一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法技术

一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，包括采集产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐血、脐带和胎盘组织，以干细胞诱导、永生化基因转染、新冠病毒靶向干扰基因装配、新冠病毒易感基因敲除或敲入、新冠病毒抗体产生基因装配的方法，制备防治新冠肺炎的永生化干细胞、DNA重组干细胞、RNA干扰干细胞、基因沉默干细胞及各种干细胞载体疫苗，将所制干细胞产品按供者姓名、ABO血型或HLA分型集中收藏于‑196℃液氮，建立可再生利用的专用干细胞库，当新冠病毒流行时可从干细胞库中提取各分型干细胞或其疫苗进行培养扩增，以患者自身或同型干细胞进行个体化治疗，以减少传统干细胞或疫苗防治的免疫排斥等副作用，并解决COVID‑19特效药物及干细胞缺乏问题。

【技术实现步骤摘要】
一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法
本专利技术涉及一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，为生物医学领域的传染病防治技术。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁，由于缺乏有效的抗病毒药物，新型冠状病毒病(COVID-19)的治疗仍充满挑战，亟需探索新的有效治疗方法，以提高临床危重型患者的救治率。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是一群起源于中胚层的多能干细胞，具有自我更新、多向分化和免疫调控潜能。MCS作为种子细胞可用于修复/替代受伤或病变的多种组织器官，全世界已开展多项MSC的临床研究，用于治疗病毒、细菌等诱发的重症肺炎、ARDS、呼吸衰竭等呼吸系统疾病。MCS具有低免疫原性和广泛的免疫调节功能，因其不表达CD40、CD80、CD86等共刺激分子和主要组织相容性复合体(MHC)II类分子，故引起免疫排斥反应的可能性较小，同时其对免疫细胞的调节效应不受MHC分子的限制，即对自体和异体的免疫细胞都可发挥免疫调节效应。MCS作为一种新型的免疫治疗方案，还具有良好的免疫调节和强大的抗炎特性，其可通过感知炎症信号迁移至炎症部位，通过直接接触和旁分泌效应发挥作用。被免疫细胞吞噬清除的MSC仍具有诱发吞噬细胞分泌IL10、TGF-β、IDO等免疫调控效应分子的能力。当COVID-19导致肺上皮细胞和内皮细胞凋亡，且诱导免疫细胞在肺部聚集和过度活化时，MSC向肺损伤部位迁移，分化为正常的肺泡上皮细胞，修复屏障功能，调节上皮细胞功能以促进肺泡内液体的清除，调节免疫功能，抑制炎性因子风暴，最终促进损伤肺组织的修复，在COVID-19的应急治疗中干细胞被赋予了较大的希望。但未见对用于COVID-19治疗的干细胞进行相关功能改造、预期收藏、自身或同型输注的文献报道。RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶(Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但未见构建新冠病毒RNA干扰载体并将所述RNA干扰载体转染干细胞从而制成新冠病毒RNA干扰型干细胞的文献报道。通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。有学者认为在同一细胞中同时导入SV40LT和hTERT，可以提高细胞永生化效率而不改变细胞的生物学性状。我们曾将SV40LT和hTERT同时导入人肝细胞，建立的细胞系被用于生物型人工肝，这为干细胞体外培养寿命的改良和产业扩增提供了依据。文献报道，SARS-CoV能在血管紧张素2转换酶(ACE2)转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也仅感染能表达ACE2的宿主细胞。在传统观念上，通常不希望SARS-CoV-2通过ACE2感染治疗用干细胞，本专利技术却以相反的方法，构建表达ACE2的重组载体，转染干细胞，以增强干细胞表达ACE2功能，从而增强干细胞对SARS-CoV-2的易感性，使干细胞在治疗中与宿主细胞竞争吸入较多的新冠病毒，以减少机体正常组织感染机会，然后通过人工装配在干细胞DNA的RNA干扰基因抑制、杀灭被ACE2吸引入干细胞内的病毒。近年国内外建立的各类细胞库保存了大量的细胞资源，如美国构建的标准细胞库(ATCC)、人类遗传突变细胞库(HGMR)、细胞衰老细胞库(CAR)等，英国构建的胚胎干细胞库，日本构建的乳牙干细胞研究库、诱导多功能干细胞库等，中国构建的中国重要医学生物资源保藏库、中国不同民族永生细胞库、中国人类遗传资源平台、脐带间充质干细胞库、脐血干细胞库、肿瘤细胞库等。这些细胞库已用于保存不同的细胞，如人肺腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肾癌细胞、人APP-PS1双基因转染细胞株(HEK293)、DMF7双位点HC-KIT受体细胞株等。但未见专用于新冠病毒传染病防治的干细胞库以及其构建方法的文献报道。
技术实现思路
基于治疗新冠肺炎的干细胞在制备、应用和收藏等方面的问题，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是提供一种新冠肺炎防治干细胞库，专用于收藏各种经基因功能优化改造的适合于新冠肺炎个体化治疗的可再生干细胞；另一目的是提供优化新冠肺炎治疗效果的干细胞基因功能改造方法及新冠肺炎防治干细胞库的构建方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实施：所述一种新冠肺炎防治干细胞库，指采集、优化制备、收藏专用于COVID-19个体化治疗的组织细胞，包括采集的羊水细胞、脐血、脐带、胎盘组织以及经干细胞功能改造的本专利技术所述永生化干细胞、基因沉默干细胞、RNA干扰干细胞载体疫苗、DNA重组干细胞、DNA重组干细胞载体疫苗，然后按供者姓名、ABO血型或HLA分型集中收藏于-196℃液氮，建立可再生利用的新冠肺炎个体化治疗专用干细胞库，当新冠病毒流行时可从预备的干细胞库中提取各分型干细胞或其疫苗进行培养扩增，以遵从患者自身或同型干细胞选用原则。所述新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，包括以下步骤：首先，获得间充质干细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞、绒毛细胞以及出生后的脐带、胎盘组织中获得间充质干细胞，或经干细胞诱导获得所需干细胞。进而，给干细胞装配永生化基因：构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，获得能永久生存、无限传代的功能。进而，给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II(ACE2)基因重组到慢病毒表达载体pGC-FU中，构建重组质粒pGC-FU-ACE2，将该质粒和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)共转染293FT细胞，包装携带ACE2的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使干细胞DNA整合上ACE2基因，以增强干细胞的病毒易感性，使之更易与宿主细胞竞争将nCoV吸入干细胞内进行RNA干扰，以减少正常宿主细胞的病毒感染机会。进而，给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：设计和优选新冠病毒N、S、M和/或E基因的靶向干扰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，包括(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐血、脐带和胎盘组织，分离间充质干细胞、羊水成纤维细胞，或以干细胞诱导的方法制备干细胞、肺干细胞；(2)将hTERT和/或SV40LT基因转染干细胞，制备永生化干细胞；(3)敲除永生化干细胞的新冠病毒易感基因hACE2和敲入新冠病毒靶向干扰基因shRNA，制备新冠病毒基因沉默干细胞；(4)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述基因沉默干细胞DNA，制备RNA干扰干细胞载体疫苗；(5)将新冠病毒易感基因hACE2和新冠病毒靶向干扰基因shRNA敲入同一永生化干细胞，制备DNA重组干细胞；(6)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述DNA重组干细胞，制备DNA重组干细胞载体疫苗；(7)将所制系列干细胞及其载体疫苗按供者姓名、ABO血型或HLA分型集中收藏于-196℃液氮，建立可再生利用的新冠肺炎个体化治疗专用干细胞库，当新冠病毒流行时可从预备的干细胞库中提取各分型干细胞或其疫苗进行培养扩增，遵从患者自身或同型干细胞选用原则。/n

【技术特征摘要】
1.一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，包括(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐血、脐带和胎盘组织，分离间充质干细胞、羊水成纤维细胞，或以干细胞诱导的方法制备干细胞、肺干细胞；(2)将hTERT和/或SV40LT基因转染干细胞，制备永生化干细胞；(3)敲除永生化干细胞的新冠病毒易感基因hACE2和敲入新冠病毒靶向干扰基因shRNA，制备新冠病毒基因沉默干细胞；(4)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述基因沉默干细胞DNA，制备RNA干扰干细胞载体疫苗；(5)将新冠病毒易感基因hACE2和新冠病毒靶向干扰基因shRNA敲入同一永生化干细胞，制备DNA重组干细胞；(6)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述DNA重组干细胞，制备DNA重组干细胞载体疫苗；(7)将所制系列干细胞及其载体疫苗按供者姓名、ABO血型或HLA分型集中收藏于-196℃液氮，建立可再生利用的新冠肺炎个体化治疗专用干细胞库，当新冠病毒流行时可从预备的干细胞库中提取各分型干细胞或其疫苗进行培养扩增，遵从患者自身或同型干细胞选用原则。


2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述新冠病毒靶向干扰基因包括新冠病毒M、N、S和/或E基因。


3.根据权利要求1、2所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、S和/或E基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。


4.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。


5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述永生化干细胞的hACE2基因敲除指构建CRISPR-Cas9质粒pX330-ACE2并转染永生化干细胞，实现hACE2基因敲除。


6.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述DNA重组干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33