一种人脐带间充质干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术公开一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，属于间充质干细胞的制备技术领域。本发明专利技术所述方法使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养，使用差速贴壁法纯化细胞，建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联；本发明专利技术所述方法生产成本低，效率高，为快速高效获得脐带间充质干细胞提供方法；此外，通过人脐带间充质干细胞库为新生胎儿建库，为其本人及家庭成员或许可第三方在需要脐带间充质干细胞移植治疗各种疾病时，提供临床适用的脐带间充质干细胞和干细胞制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞库的构建方法
本专利技术涉及一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，间充质干细胞的制备

技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSCs)的分离提取和培养的方法简单，增殖能力强，选用自体组织来源的MSCs进行治疗符合了伦理学要求；此外，MSCs还具有较低的免疫原性和低致瘤性，强大的抗炎能力、瘢痕抑制能力以及免疫抑制作用。其中脐带间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSCs)是存在于脐带华通胶和血管周围组织中的一种非定向干细胞。这群细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的一种多能干细胞，可以保持其原始表型而无自发分化，具有有限寿命和干细胞的一般特性；相比于其他类型的MSCs，hMSCs的优势在于：①脐带来源充足，容易收集，可以通过非侵入性手段获得，不受伦理及法理限制；②脐带受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；③hMSCs的免疫源性更低，能耐受更大限度上的人类白细胞抗原的配型不符；④hMSCs体外倍增时间短，扩增能力强；⑤收集的hMSCs不仅可以作为异体移植的供体，而且还可以将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。目前，脐带间充质干细胞分离方法包括胶原酶-胰酶消化法和组织贴壁法，酶消化法初步所得贴壁细胞并非单一细胞群体，其中可能含有多种成分的异质性细胞群。原代贴壁细胞中含有多个核、小圆形细胞，也需长时间贴传代纯化。并且使用的普通培养基添加胎牛血清，因存在动物源成分存在，不利于移植应用，此外，数据库的建立不完善，不能追踪细胞来源与细胞安全性，因此，需要建立简单有效的分离方法，和完善的信息数据库。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞库的建立方法，使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养，使用差速贴壁法纯化细胞，该方法生产成本低，效率高，为快速高效获得脐带间充质干细胞提供方法。本专利技术所述的脐带间充质干细胞分离方法，具体包括以下步骤：(1)采集胎儿脐带组织，使用生理盐水冲洗2～3次，尽可能除去残留血液，剔除脐动脉、脐静脉和脐带外膜后即可获得华通胶。(2)在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥5～10min，加入3～5ml无血清培养基，每1～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁移及生长状况。(3)传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去。(4)冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内。(5)建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。进一步的，本专利技术步骤(3)中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中。进一步的，本专利技术步骤(4)中的冻存液成分包括：70％无血清培养基，20％胎牛血清(ThermoFisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)。本专利技术所述脐带间充质干细胞的数据库包括以下内容：(1)细胞活性检测：利用台盼蓝染色后计数，记录冻存细胞在冻存前后的细胞数目，利用MTT法绘制生长曲线。(2)细胞感染的检测：利用少量细胞培养，检测是否受到细菌、真菌及支原体的污染，并检测是否存在动物来源的物质；并检测是否存在细小病毒。(3)遗传病的检测：利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。(4)细胞致癌性检测：利用软琼脂克隆形成和实验端粒酶活性检测细胞的致癌性，并记录。(5)HLA-ABC/DR配型：检测HLA-ABC/DR表型，并记录在案。(6)细胞来源的记录：记录供者详细资料，并记录在案。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术利用划痕固定华通胶，并通过减少原代培养中的培养基，使组织与培养皿贴合更好，利于细胞迁移，之后续加培养基，而非换液，有利于保留华通胶中的生长因子，促进细胞生长；在传代过程中，利用差速贴壁法，加快纯化速率。(2)本方法采用完全无血清培养基进行培养，避免了动物源血清成分的干扰，安全性高，达到临床级别建库工艺，有利于后期临床应用。(3)本专利技术所述方法为新生胎儿建库，为其本人及家庭成员或许可第三方在需要脐带间充质干细胞移植治疗各种疾病时，提供临床适用的脐带间充质干细胞和干细胞制剂。附图说明图1脐带间充质干细胞由华通胶块中爬出生长；图2脐带间充质干细胞呈长梭形，漩涡状贴壁生长；图3脐带间充质干细胞的成脂分化潜能；图4脐带间充质干细胞的成骨分化潜能；图5脐带间充质干细胞的成软骨分化潜能；图6脐带间充质干细胞表面标记物流式细胞学检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的保护范围并不限于所述内容。本专利技术与供者签订知情同意书，收集健康正常足月分娩胎儿的脐带5-10cm，同时采集10mL供者血样并检测供者血型、HA-ABC/DR配型、传染病(乙肝、丙肝、巨细胞病毒、EB病毒、梅毒、艾滋病病毒)，保证其各项指标正常。本专利技术所用试剂无血清人间充质干细胞培养基、细胞消化液等试剂如无特殊说明，均为市售产品。实施例1一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，具体包括以下步骤：(1)将收集的脐带在超净台中用生理盐水冲洗3次后，钝性分离脐动脉、脐静脉和脐带外膜后即可获得华通胶；使用一次性手术刀在10cm培养皿(Corning)进行随机直线划痕，以便固定华通胶。(2)将华通胶剪成0.5cm大小的组织块，使用手术刀固定于划痕中；将固定好组织的培养皿在超净台中干燥5min，使华通胶与培养皿黏附更紧密。(3)在培养皿中加入4ml间充质干细胞无血清培养基(京蒙)，置于37℃，5％CO2培养箱中，每3天续加2ml培养基，观察细胞爬出生长情况(见图1)，由图1可以看出组织接种7-10天后长梭形细胞迁移生长，围绕组织块周围。(4)待组织块周边细胞融合度90％左右，使用细胞消化液(京蒙)2ml，37℃消化3-5min，显微镜下观察细胞成圆形，晃动培养皿，可见细胞脱落；加入2ml无血清培养基终止反应，收集入15ml离心管，1000rpm，离心3min，收集细胞；按1:3的比例传代，记为P1，隔天全量换液。(5)在传代细胞融合度至95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞放弃，经传代后，可见如图2所示形态规则，成漩涡状生长的脐带间充质干细胞。(6)并将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，冻存液成分：70％无血清培养基，20％胎牛血清(ThermoFisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)；放入程序性冻存盒(Corning)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n(1)采集胎儿脐带组织，使用生理盐水冲洗2～3次，去除残留血液，剔除脐动脉、脐静脉和脐带外膜后得到华通胶；/n(2)在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥5～10min，加入3-5ml无血清培养基，每2～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁移及生长状况；/n(3)传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；/n(4)冻存：将部分细胞离心后以3-4×10

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)采集胎儿脐带组织，使用生理盐水冲洗2～3次，去除残留血液，剔除脐动脉、脐静脉和脐带外膜后得到华通胶；
(2)在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥5～10min，加入3-5ml无血清培养基，每2～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁移及生长状况；
(3)传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；
(4)冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内；
(5)建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。


2.根据权利要求1所述人脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于：步骤(3)中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中。

【专利技术属性】
技术研发人员：马隽，崔慧先，孔德胜，郭瑞云，冯宝峰，张薇，何晶晶，刘鑫，杜晓峰，马振环，
申请(专利权)人：河北医科大学，河北多能干细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13