一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒技术

一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒，该方法包括：延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标探针混合，靶标探针结合至模板分子的靶标区域并延伸，获得靶标探针延伸产物；第二测序接头连接步骤，包括加入第二测序接头，第二测序接头具有互补配对的正向链、反向链，正向链的5’端可串联连接至靶标探针延伸产物的3’端，反向链的3’端串联有随机序列，反应得到第二测序接头连接产物；解链处理，去除产物中串联有随机序列的单链分子，得到串联有第一测序接头的单链产物；双链合成步骤，包括加入第一引物、第二引物，反应得到扩增产物。本发明专利技术将建库与靶向基因富集整合，广泛适用于各种长度和高低起始量的单链或双链DNA样本。

【技术实现步骤摘要】
一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒
本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒。
技术介绍
现有的下一代测序(NGS)的靶向测序样本制备需要经历建库、捕获前扩增、杂交捕获和捕获后扩增四大步骤，这几部分彼此串联缺一不可，整个流程加起来需要约2到3天时间，不仅费时费钱，而且各个步骤之间的衔接有一定的难度。并且，还需要对起始DNA进行打断前处理，并在建库后做文库片段长度筛选。因此，现有的建库技术难以针对严重降解的样本或者微量DNA样本(一般DNA量低于20ng即难以保证建库质量)。另外，捕获前后的两轮扩增均为指数性扩增，会带来大量错误和偏好性，造成过高的技术错误本底，而导致低频率(低于千分之一)的基因突变检测无法进行。
技术实现思路
根据第一方面，一种实施例中提供一种单分子靶标基因建库方法，包括：延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标靶标探针延伸产物；第二测序接头连接步骤，包括向延伸步骤所得的反应体系中加入第二测序接头，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至所述靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联有随机核苷酸序列，反应得到第二测序接头连接产物，然后解链处理，去除产物中串联有随机核苷酸序列的单链，得到串联有第一测序接头的单链产物；双链合成步骤，包括向串联有第一测序接头的单链产物中加入第一引物、第二引物，反应得到可用于上机测序的扩增产物，所述第一引物含有互补配对于所述第一测序接头的序列，所述第二引物含有互补配对于所述第二测序接头的序列。根据第二方面，一种实施例中提供采用第一方面所述方法构建得到的文库。根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，包括第一测序接头、第二测序接头，所述第一测序接头串联连接有靶标探针，所述靶标探针可结合至模板分子的靶靶标区域并延伸反应，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联连接有随机核苷酸序列。依据上述实施例的单分子靶标基因建库方法及其试剂盒，将建库步骤与靶向基因富集步骤相结合，无需片段化处理，有效缩短建库所需时间，提高建库效率。本方法或试剂盒可适用于各种长度的单链或双链DNA样本，RNA逆转录成的cDNA、亚硫酸氢盐处理的DNA(用于DNA甲基化测序)、各类严重降解的DNA(福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织或法医样本提取的DNA、体液所含游离DNA(cfDNA)等)，且起始量适用范围广谱(0.1至1000纳克)。附图说明图1为一实施例中的建库流程图；图2为一实施例中的第二测序接头接头图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。本文中，高通量测序样本DNA文库构建，简称建库。常规的建库技术流程为：通过一系列酶促反应将双链DNA分子末端修平整，再于DNA分子两端分别连接上双链的第一测序接头和第二测序接头。本文中，“μM”是指μmol/L，为浓度单位，中文为微摩尔每升。发夹式结构(hairpinstructure，也可表述为发卡式结构)是指：由一对反向重复序列折叠配对形成的特定空间结构。现有技术中，NGS靶向文库的制备流程(包括新型建库方法单链建库)一般分为两套流程，主流的捕获建库方法需要经历文库构建、捕获前扩增、杂交捕获、捕获后扩增四个必需步骤，全流程一般耗时长达2到3天。另一种常见方法称为扩增子建库，一般先做多重PCR，后对PCR产物建库，有的商业化试剂盒会在做多重PCR时在引物的5’端外侧加上对应NGS平台的接头序列，以将上述两步整合为一步。第一种主流技术路线必须将文库构建和杂交捕获严格分开，步骤繁多，周期长，且依赖基于链霉亲和素与生物素连接的磁珠捕获，磁珠价格昂贵且依赖进口。第二种技术路线虽然流程较前者更简洁，但因其基于多重PCR，有如下诸多问题：1、建库起始投入量需要较高；2、同一反应体系里靶标位点数(plex数)无法过多，导致较大探针库(panel)的基因检测很难通过单管反应完成，只能分成多个单管反应，然后合并产物来实现，大大升高了成本和操作时间，限制了单管反应检测通量，不利于推广；3.PCR需要两端引物配对，导致其无法检测未知基因融合(novelfusion)和病毒插入位点等结构性变异；4.PCR的指数性扩增导致基因拷贝数变异无法检测；5、多重PCR不可避免地扩增偏好性导致均一度低，导致panel的靶标区域中部分区域不能很好覆盖，而部分区域过多覆盖。相比而言，在一些实施例中，本专利技术将建库和靶标基因富集这两个步骤整合为一个流程，这一革命性的创新不仅克服了主流的建库加杂交捕获流程的步骤繁多成本高昂的缺点，同时也通过线性扩增规避了扩增子建库所固有的单管反应检测通量小、均一性差、无法有效检测基因组结构性变异和基因拷贝数变异等缺陷。在一些实施例中，因为建成的文库的P5端带分子标签，可有效矫正PCR和测序错误，从而实现超低频检测。在一些实施例中，本专利技术在适用样本上也有巨大优势，适用的DNA样本类型广泛，对严重降解和微量这些常规NGS技术无法胜任的样本，而临床检测应用中的很多样本均属此类，如FFPE(福尔马林固定和石蜡包埋)样本提取的DNA、体液(血浆、胸腔积液、尿液等)的胞外游离DNA等。而且对样本长度无要求，对长片段的完整的基因组DNA无需打断，节省时间和成本。在一些实施例中，适用于本专利技术的样本起始量在0.1至1000ng之间，尤其适用于低起始量的样本。第一方面，在一些实施例中，提供一种单分子靶标基因建库方法，包括：延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标探针延伸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单分子靶标基因建库方法，其特征在于，包括：/n延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标靶标探针延伸产物；/n第二测序接头连接步骤，包括向延伸步骤所得的反应体系中加入第二测序接头，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至所述靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联有随机核苷酸序列，反应得到第二测序接头连接产物，然后解链处理，去除产物中串联有随机核苷酸序列的单链，得到串联有第一测序接头的单链产物；/n双链合成步骤，包括向串联有第一测序接头的单链产物中加入第一引物、第二引物，反应得到可用于上机测序的扩增产物，所述第一引物含有互补配对于所述第一测序接头的序列，所述第二引物含有互补配对于所述第二测序接头的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种单分子靶标基因建库方法，其特征在于，包括：
延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标靶标探针延伸产物；
第二测序接头连接步骤，包括向延伸步骤所得的反应体系中加入第二测序接头，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至所述靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联有随机核苷酸序列，反应得到第二测序接头连接产物，然后解链处理，去除产物中串联有随机核苷酸序列的单链，得到串联有第一测序接头的单链产物；
双链合成步骤，包括向串联有第一测序接头的单链产物中加入第一引物、第二引物，反应得到可用于上机测序的扩增产物，所述第一引物含有互补配对于所述第一测序接头的序列，所述第二引物含有互补配对于所述第二测序接头的序列。


2.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述模板分子为单链DNA；
和/或，所述模板分子选自双链DNA解链处理后得到的单链DNA、RNA逆转录得到的cDNA中的至少一种；
和/或，所述模板分子来源于亚硫酸氢盐处理的DNA、福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织的DNA、法医样本提取的DNA、体液所含游离DNA(cfDNA)、古生物化石或考古发掘的生物遗存中提取的DNA样本中的至少一种；
和/或，所述模板分子的起始量为0.1至1000纳克；
和/或，所述靶探探针延伸产物为单链DNA。


3.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第二测序接头的正向链的5’端修饰有磷酸基团；
和/或，所述第一测序接头与所述靶标探针之间串联有分子标签；
和/或，所述分子标签的长度为4-19nt。


4.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第二测序接头的反向链的3’端串联的随机核苷酸序列的长度为5-15nt。


5.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第一引物含有可与所述第一测序接头互补配对的序列，所述第二引物含有可与所述第二测序接头互补配对的序列；
和/或，所述第一引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第一测序接头反向互补配对；
和/或，所述第一引物含有或不含有第一样本标签；
和/或，所述第一引物含有第一样本标签时，第一样本标签位于所述内接头序列、外接头序列之间；
和/或，所述第一样本标签的长度为4-15nt；
和/或，所述第二引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第二测序接头反向互补配对；
和/或，所述第二引物含有或不含有第二样本标签；
和/或，所述第二引物含有第二样本标签时，所述第二样本标签位于所述内接头序列、外接头序列之间；
和/或，所述第二样本标签的长度为4-15nt；
和/或，延伸步骤中，延伸反应的扩增循环数≥1；
和/或，延伸步骤中，延伸反应的扩增循环数为5-500个循环；
和/或，延伸步骤中，每个循环反应如下：94-98℃，10-60秒；55-65℃，10-60秒；68-72℃，10-60秒。


6.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，第二测序接...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔品，
申请(专利权)人：深圳市睿法生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44