一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，所述方法为：取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。实验结果表明，本发明专利技术提供的液相纯化方法可以有效去除DNA编码化合物库合成过程中引入的单段DNA片段，还能够有效去除多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质，能够显著提升DNA编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法
本专利技术涉及一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法。
技术介绍
在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(AccountsofChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。DNA编码化合物库(DEL)的构建利用组合化学的“组合-拆分”策略，可快速得到数量巨大的化合物库，并且化合物中的每一维结构信息都可以由唯一的DNA片段进行标记。在DNA编码化合物库的构建过程中，每一维度都需要加入过量的DNA片段进行反应以保证化合物被正确标记。然而过量的DNA片段会继续与下一维度的DNA片段发生反应，导致后续的磁珠纯化不完全，从而影响最终DNA编码化合物库的纯度。另外由于DNA编码化合物库的成本大部分来自于DNA片段，过量的DNA片段会增加下一维度DNA片段的使用量，从而导致构建成本的大幅增加。中国专利201610229301.0公开了一种固相合成DNA编码化合物库的方法，该专利对固相合成DNA编码化合物生产过程中的粗产物用蒸馏水和0.1MTEAA(醋酸三乙胺)缓冲溶液洗涤，进行纯化。但是，该纯化方法仅用于固相合成的纯化，并且不能除去未反应的DNA片段。目前液相合成DNA编码化合物库常用的纯化方法(如TEAA体系)并不能很好地除去未反应的DNA片段，因此，开发一种新的能够有效除去过量DNA片段的纯化方法，能大幅节约构建化合物库的成本，并且提高DNA编码化合物库的纯度，可以极大地提高DNA编码化合物库的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法。本专利技术提供了一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。进一步地，所述流动相中，B相的体积百分数为1％～90％。进一步地，所述A相由水、二异丙基乙胺和六氟异丙醇组成。进一步地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.01～1％，六氟异丙醇的体积百分数为0.5％～10％，其余为水；优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.05～0.5％，六氟异丙醇的体积百分数为1％～5％，其余为水；更优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.15％，六氟异丙醇的体积百分数为2.5％，其余为水。进一步地，所述B相为甲醇。进一步地，所述方法中，洗脱条件如下：时间(min)梯度(B％，v/v)012112451390169016.11201或时间(min)梯度(B％)02424.117165716.59018.590192252。进一步地，所述DNA编码化合物或其中间体的DNA部分长度为25～80bp。进一步地，利用液相色谱柱进行洗脱除去的部分为长度10～60bp的单段DNA片段，或n个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质；其中n为2、3或4。进一步地，所述液相色谱柱为C18色谱柱，优选为WatersXBridgeBEHShieldRP18或YMCTriantC18。进一步地，所述液相色谱柱的柱温为35～45℃。本专利技术中，ACN为乙腈，DIEA为二异丙基乙胺，HFIP为六氟异丙醇，MEOH甲醇，TEAA为醋酸三乙胺。本专利技术中DNA编码化合物中间体表示制备DNA编码化合物库终产物之前得到的、连接了DNA片段的中间产物。本专利技术中DNA编码化合物或其中间体中的DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链。本专利技术的液相色谱纯化方法适用于C18色谱柱，可以根据分离样品量选择不同大小的色谱柱。实验结果表明，本专利技术提供了一种DNA编码化合物库的液相纯化方法，该方法以水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇、甲醇为洗脱剂，可以将长度为10～60bp的单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质与DNA部分长度为25～80bp的DNA编码化合物或其中间体分离。本专利技术的方法不仅能够有效的去除DEL生产过程中的单段DNA片段，还能够有效除去多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质，能够显著提升DNA编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少DNA片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1DNA编码化合物库合成过程中的单次纯化步骤示意图。图2DNA编码化合物库合成过程中的多次纯化步骤示意图。图3实施例1中使用TEAA体系分离的HPLC图谱。图4实施例2中使用本专利技术方法分离的HPLC图谱。图5实施例2中使用本专利技术方法纯化前(a)、后(b)HPLC对比图。图6实施例2中使用本专利技术方法纯化前(a)、后(b)LC-MS对比图，图中的“DNA短片段”表示单段DNA片段。图7实施例2中未使用本专利技术方法纯化组分(a)、使用本专利技术方法纯化后组分(b)连接下一维度DNA片段的凝胶电泳对比图。图8实施例3中使用本专利技术方法分离的HPLC图谱，图中的“DNA短片段”表示单段DNA片段或多个单段DNA片段相连生成的DNA片段杂质。图9实施例3中使用本专利技术方法纯化前(a)、后(b)HPLC对比图，图中的“DNA短本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，所述方法为：取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于DNA编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，所述方法为：取DNA编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，A相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，B相含有甲醇。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述流动相中，B相的体积百分数为1％～90％。


3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述A相由水、二异丙基乙胺和六氟异丙醇组成。


4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.01～1％，六氟异丙醇的体积百分数为0.5％～10％，其余为水；
优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.05～0.5％，六氟异丙醇的体积百分数为1％～5％，其余为水；
更优选地，所述A相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.15％，六氟异丙醇的体积百分数为2.5％，其余为水。


5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述B相为甲醇。


6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于：所述方法中，洗脱条件如下：






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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡玫烜，曾善超，张星河，何文彬，万金桥，李进，
申请(专利权)人：成都先导药物开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51