前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系、诱导培养方法及应用技术

本发明专利技术提供了前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系、诱导培养方法及应用，包含基础培养基以及与其分别组合使用的诱导分化因子和体外培养因子。其中，基础培养基包括DMEM/F12液体基础培养基、0‑5×B27添加剂、0‑5×N2添加剂、1％青霉素/链霉素、0.01‑500μg/mL 2‑磷酸‑维生素C；诱导分化因子包括0.01‑500μM TGFβ抑制剂、0.01‑10000μM BMP抑制剂、0.01‑50μM Porcupine抑制剂；体外培养因子包括0.01‑10000nM Src激酶抑制剂、0.01‑500μM TGFβ抑制剂、0.01‑50μM GSK3抑制剂、0.01‑500ng/mL EGF家族生长因子、0.01‑500ng/mL FGF家族生长因子。使用该培养体系，可以在体体外诱导多能干细胞分化为前脑神经干细胞及体外长期培养，并维持稳定的前脑神经干细胞的分子表型和分化潜能。

【技术实现步骤摘要】
前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系、诱导培养方法及应用
本专利技术涉及生物医药工程
，涉及一种于体外诱导人多能干细胞分化为前脑神经干细胞，并维持前脑神经干细胞长期培养的体系和方法。
技术介绍
神经退行性疾病是一类发生在神经系统中，造成神经元及其附属树突、轴突和突触，以及遍布神经系统的胶质细胞发生损伤或者功能异常的疾病。近年来，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症等神经退行性疾病的发病率急剧上升。目前我国患帕金森超过300万人，渐冻症已超20万人，更有报道老年痴呆人数已超千万，并且随着人口老龄化的加剧，神经退行性疾病将会成为严重的医学和社会学问题。神经退行性疾病有几个重要的病理特征：一是小胶质细胞介导的神经炎症；二是神经系统内的细胞死亡；三是细胞内稳态的失调造成的病理蛋白的聚集。目前针对神经退行性疾病的干预研究主要包括抑制神经炎症和细胞死亡。但由于人体的中枢神经系统在损伤后自我修复能力是有限的，所以外源神经干细胞移植有望成为治疗神经退行性疾病的重要手段之一。哺乳动物的大脑皮层，由神经管最前端的背侧面发育而来，是一个高度组织化的六层结构，几乎控制了所有的高级认知功能。大脑新皮层六层结构的形成涉及到神经干细胞和前体细胞的增殖和各种神经元的分化、迁移等多个生物学过程。诱导人多能干细胞分化为自我更新的前脑神经干细胞不仅可以为神经退行性疾病的细胞治疗提供充足的细胞来源，同时也可用在体外研究人类大脑皮层的发育、细胞命运选择和神经系统疾病的发病机制。目前，本领域尚缺乏有效手段于体外稳定维持前脑神经干细胞的分子表型和自我更新，尤其是无法在化学成分明确的培养条件下实现体外前脑神经干细胞的长期维持。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述问题而进行的，针对现有技术中前脑神经干细胞体外培养过程中难以维持前脑神经干细胞的分子表型和各项功能的缺陷，提供了一种体外获得及长期培养前脑神经干细胞的培养体系和方法。本专利技术的第一方面，提供了前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，用于体外诱导人多能干细胞分化为前脑神经干细胞并能够在体外长期培养，包含基础培养基以及与该基础培养基分别组合使用的诱导分化因子和体外培养因子。其中，基础培养基(BM)包括DMEM/F12液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青霉素/链霉素、0.01-500μg/mL2-磷酸-维生素C。诱导分化因子包括0.01-500μM转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、0.01-10000μM骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、0.01-50μMPorcupine抑制剂；体外培养因子包括、0.01-10000nMSrc激酶抑制剂、0.01-500μMTGFβ抑制剂、0.01-50μM糖原合成酶3(GSK3)抑制剂、0.01-500ng/mL上皮生长因子(EGF)家族生长因子、0.01-500ng/mL成纤维生长因子(FGF)家族生长因子。在基础培养基中添加诱导分化因子，可于体外将人多能干细胞诱导为前脑神经干细胞；添加体外培养因子，用于诱导得到人前脑神经干细胞的体外长期培养。使用该培养体系，人的前脑神经干细胞于体外可以长期培养并维持前脑神经干细胞的分子表型及功能长达20代，且具备移植到体内后存活、分化为神经元的能力。优选的，各培养基中各组分的最优浓度如下：基础培养基中，B27添加剂的量为0.5×B27添加剂，N2添加剂的量为0.5×N2添加剂，2-磷酸-维生素C的浓度为60μg/mL。诱导分化因子中，TGFβ抑制剂包括但不限于SB431542、LY2109761及A-83-01等小分子TGFβ受体抑制剂中的一种或多种；BMP抑制剂包括但不限于DMH1、K02288、LDN-193189等小分子BMP受体抑制剂中的一种或多种，以及Noggin等BMP抑制蛋白；Porcupine抑制剂包括LGK974，GNF-6231，Wnt-C59中的一种或多种。体外培养因子中，Src激酶抑制剂包括但不限于Dasatinib、Saracatinib及KX2-391等小分子Src激酶抑制剂中的一种或多种；TGFβ抑制剂包括SB431542、LY2109761及A-83-01中的一种或多种；GSK3抑制剂包括但不限于CHIR99021、BIO及LY2090314等小分子GSK3抑制剂中的一种或多种；EGF家族生长因子包括但不限于EGF、TGFα及HB-EGF中的一种或多种；FGF家族生长因子包含但不限于FGF1～FGF23中的任意一种或多种。进一步优选，诱导分化因子中，TGFβ受体抑制剂SB431542的浓度为2μM，BMP受体抑制剂DMH1的浓度为1μM、Porcupine抑制剂LGK974的浓度为0.1μM；该培养体系命名为SDL培养体系。体外培养因子中，Src激酶抑制剂Dasatinib的浓度为5nM，TGFβ受体抑制剂SB431542的浓度为2μM，GSK3抑制剂CHIR99021的浓度为1μM、EGF家族生长因子EGF的浓度为10ng/mL、FGF家族生长因子FGF2的浓度为20ng/mL；该培养体系命名为SCDEF培养体系。本专利技术的具体实施方式中，采用上述组分进行实验，但每种组分中不限于上述具体成分。如，TGFβ抑制剂中，选择2μM的SB431542进行实验，但LY2109761及A-83-01也能实现相应功能。其他组分的成分选择亦然。本专利技术的第二方面，提供了采用上述培养体系体外诱导多能干细胞分化为前脑神经干细胞并维持其自我更新的方法，包括如下步骤：A、体外诱导采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被培养支持物(如培养皿)，并于4℃保存过夜；采用人多能干细胞培养基将人多能干细胞培养至细胞密度为50％-70％；将细胞以低密度(10％左右)接种于基质胶预先包被培养支持物(，采用基础培养基和诱导分化因子组成的诱导培养基(SDL培养体系)培养7天，获得前脑神经干细胞；B、前脑神经干细胞体外长期培养采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被培养支持物，并于4℃保存过夜；将获得的前脑神经干细胞以高密度传代后，采用基础培养基和体外培养因子组成的体外更新培养基(SCDEF培养体系)继续培养，早期以1:2传代，培养5代之后以1:5传代长期培养。结果显示，SDL培养体系可以在体外诱导人多能干细胞分化为前脑神经干细胞，SCDEF培养体系可以在体外长期培养前脑神经干细胞，并且能维持前脑神经干细胞分子标志的表达。采用上述培养体系，可将哺乳动物多能干细胞诱导分化为哺乳动物的前脑神经干细胞并能够体外进行长期培养。特别的，更适用于将人多能干细胞诱导分化为人前脑神经干细胞并进行体外自我更新。此外，采用上述培养体系得到的前脑神经干细胞，可体外分化成前脑皮层神经元，包括如下步骤：1、单层分化：A、采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被培养支持物(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于，用于体外诱导人多能干细胞分化为前脑神经干细胞并能够于体外长期培养，包含基础培养基以及与该基础培养基分别组合使用的诱导分化因子和体外培养因子。/n所述诱导分化因子包括0.01-500μM TGFβ抑制剂、0.01-10000μM BMP抑制剂、0.01-50μM Porcupine抑制剂；/n所述体外培养因子包括0.01-10000nM Src激酶抑制剂、0.01-500μM TGFβ抑制剂、0.01-50μM GSK3抑制剂、0.01-500ng/mL EGF家族生长因子、0.01-500ng/mL FGF家族生长因子。/n

【技术特征摘要】
1.一种前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于，用于体外诱导人多能干细胞分化为前脑神经干细胞并能够于体外长期培养，包含基础培养基以及与该基础培养基分别组合使用的诱导分化因子和体外培养因子。
所述诱导分化因子包括0.01-500μMTGFβ抑制剂、0.01-10000μMBMP抑制剂、0.01-50μMPorcupine抑制剂；
所述体外培养因子包括0.01-10000nMSrc激酶抑制剂、0.01-500μMTGFβ抑制剂、0.01-50μMGSK3抑制剂、0.01-500ng/mLEGF家族生长因子、0.01-500ng/mLFGF家族生长因子。


2.根据权利要求1所述的前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于：
其中，所述基础培养基包括DMEM/F12液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青霉素/链霉素、0.01-500μg/mL2-磷酸-维生素C；
所述GSK3抑制剂包括CHIR99021、BIO及LY2090314中的一种或多种；
TGFβ抑制剂包括SB431542、LY2109761及A-83-01中的一种或多种；
BMP抑制剂包括DMH1、K02288、LDN-193189、Noggin中的一种或多种；
Porcupine抑制剂包括LGK974，GNF-6231，Wnt-C59中的一种或多种；
EGF家族生长因子包括EGF、TGFα及HB-EGF中的一种或多种；
FGF家族生长因子包含FGF1～FGF23中的任意一种或多种；
Src激酶抑制剂包括Dasatinib、Saracatinib及KX2-391中的一种或多种。


3.根据权利要求2所述的前脑神经干细胞体外诱导及长期培养体系，其特征在于：
其中，B27添加剂的量为0.5×B27添加剂，N2添加剂的量为0.5×N2添加剂，2-磷酸-维生素C的浓度为60μg/mL。


4.根据权利要求2所述的前脑神经干细胞体外...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文林，袁媛，李铁军，章越凡，虞欣璐，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31