【技术实现步骤摘要】
一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法
本专利技术属于细胞分离培养
,具体地涉及一种角膜缘上皮干细胞分离培养方法。
技术介绍
角膜缘干细胞是指角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分,位于角膜缘上皮细胞基底层内,主要功能是更新修复角膜上皮,是角膜上皮更新的源泉,维持角膜完整性。培养角膜缘干细胞是基于对角膜缘干细胞的深入认识和对传统方法的重大革新,具有良好的发展前景。培养后的角膜干细胞分化及生理生化的变化、如何选择安全可靠的载体、培养的干细胞如何效果会更好、异体移植后如何降低排斥反应的发生等一延系列问题都亟待解决。角膜缘干细胞移植术是治疗眼表疾病、重建角膜结构的有效手段。我国每年所实施的角膜移植例数远不及每年递增的角膜病患者。角膜缘组织极少,对供眼无潜在威胁;培养的细胞可冰存用于二次手术;能抑制眼表急性病变的发展迅速恢复术眼正常的眼表结构;可避免使用异体移植而导致的免疫排斥反应;解决了供体来源不足的难题。这一方法是最有前途的研究方向,一旦该方法研究成熟,可解决角膜缘干的来源。由于干细胞对角膜创伤的愈合及透明性维持等方面具有重要作用,通过对体外培养的角膜缘干细胞增殖分化特性的研究可以加深对干细胞的认识,为将来进行异体干细胞移植准备条件。目前对于角膜缘干细胞没有简单有效且排斥反应低的分离培养方法。公开号为CN109423474A的中国专利技术专利申请揭露一种培养人类角膜缘干细胞的方法,其步骤包含:预处理一滋养细胞;将滋养细胞接种于一多孔膜;将多孔膜置入一容器中,使容器分隔为第一培养室 ...
【技术保护点】
1.一种角膜缘干细胞的分离培养方法,包括以下步骤:/n(1)无菌条件下获取角膜并清洗;/n(2)减除残留的巩膜、结膜和虹膜;/n(3)加入中性蛋白酶II4°C过夜消化,轻微搅动;/n(4)将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min;/n(5)用DMEM/F-12/GASP清洗角膜;/n(6)解剖显微镜下,小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞,去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱;/n(7)用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片;/n(8)加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP;/n(9)离心,弃上清;/n(10)用DMEM/F 12/GASP清洗,离心,弃上清;/n(11)加入LSC培养基,培养基配方具体为:5mL 100×双抗、10~20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/mg、5-10ng/ml白介素-6、15~20%胎牛血清、余量为DMEM/F12,将细胞拍散并用血细胞计数板计数;/n(12)将细胞以一定密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或 ...
【技术特征摘要】
1.一种角膜缘干细胞的分离培养方法,包括以下步骤:
(1)无菌条件下获取角膜并清洗;
(2)减除残留的巩膜、结膜和虹膜;
(3)加入中性蛋白酶II4°C过夜消化,轻微搅动;
(4)将加入中性蛋白酶II的角膜放人4°C摇床摇30min;
(5)用DMEM/F-12/GASP清洗角膜;
(6)解剖显微镜下,小心去除角膜中央的上皮细胞并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞,去除过程中多数的中央上皮细胞已经剥脱;
(7)用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片;
(8)加入等体积DMEM/F-12/2FB/GASP;
(9)离心,弃上清;
(10)用DMEM/F12/GASP清洗,离心,弃上清;
(11)加入LSC培养基,培养基配方具体为:5mL100×双抗、10~20ng/ml人重组EGF、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/mg、5-10ng/ml白介素-6、15~20%胎牛血清、余量为DMEM/F12,将细胞拍散并用血细胞计数板计数;
(12)将细胞以一定密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上,每三天更换一次培养基,流式细胞检测表面标志物的阳性表达率;
(13)当细胞汇合度达到90%时用胰蛋白酶消化传代;
(14)细胞收集,冻存。
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【专利技术属性】
技术研发人员:张晓南,吴芳春,侍晓云,谷涌泉,张斌,霍文卓,
申请(专利权)人:北京昱龙盛世生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:北京;11
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