一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途技术

本发明专利技术公开了一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途。具体而言，此种方法建立的细胞系高表达神经干细胞标记物Nestin、Musashi、Sox2、CD133等，传代至P20代时依然保持较高的干性，稳定性高。此细胞系培养上清对过氧化氢、氧糖剥夺所致神经细胞损伤具有显著改善作用，对脑卒中急性期及后遗症期动物模型均具有显著改善作用，可以作为脑卒中防治药物应用。

A preparation method of human adult neural stem cells and its application in prevention and treatment of stroke

【技术实现步骤摘要】
一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途
本专利技术属于细胞生物学、神经药理学领域，具体涉及一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途。
技术介绍
我国已进入老龄化社会，老龄化速度已快于总人口增长速度。各种老年病患者人数和比例也呈上升趋势。脑卒中作为中老年人的多见病，在我国已经成为了仅次于心血管病的第二大死亡杀手，严重威胁人类生命健康。目前尚未有防治此类疾病的特效药物，因此开发出具有靶向性、副作用小、能有效控制病情的药物势在必行。神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。近年来，随着干细胞技术的研究和发展，研究人员发现神经系统损伤疾病发生时损伤丢失的神经细胞可以通过移植干细胞来修复，且这种方法十分有效。但是，常规NSCs培养方法最终能获得的细胞数量有限，不能满足临床治疗需要。一方面，要达到对多人的治疗效果，通常需要获得多个胚胎组织样本，如此存在较大的伦理学争议。另一方面，不同样本来源的细胞生物学性状存在差异，由此导致的结果也存在一定的变异性，因而影响了科学数据的准确性。因此，建立稳定的可长期扩增的NSCs细胞系，此细胞系在传代20代以上时，依然保持NSCs生物学性状不变，可以有效的进行临床研究。
技术实现思路
鉴于以上问题，本专利技术的主要目的在于提供一种人成体神经干细胞系的建立方法及其在脑卒中防治中的用途。本专利技术提供的该种神经干细胞的传代方法，包括神经干细胞培养基和神经干细胞传代培养两个步骤。<br>所述神经干细胞传代培养基由基础培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、腐胺、Notch1、WNT3a、黄体酮、亚硒酸钠、胰岛素生长因子、层粘蛋白组成；B27为1×，表皮生长因子浓度20ng/ml，成纤维细胞生长因子浓度20ng/ml，胰岛素10mg/ml，腐胺16.2mg/L，Notch150nmol/L，WNT3a20nmol/L，黄体酮20nmol/L，亚硒酸钠5ug/L，胰岛素生长因子25mg/ml，层粘蛋白5μg/ml，所述基础培养基由DMEM/F12、HEPES和碳酸氢钠组成，其中，DMEM/F12为1×，HEPES浓度为20mmol/L，碳酸氢钠浓度为10mmol/L。其中，所述神经干细胞传代培养具体包括以下步骤：1).半量换液及收集神经干细胞条件培养基：当神经干细胞原代培养的半数神经球直径超过150μm时，竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞原代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养。再将上述吸出的半量培养基收集到离心管中，500g/min离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；2).预处理：在神经干细胞传代前一天，向新的T75细胞培养瓶中加入5ml神经干细胞条件培养基，备用；3).消化传代：当神经干细胞培养7-9天约半数神经球直径超过250μm时，将神经干细胞及培养基收集到50ml离心管中，500g/min离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用。将神经干细胞球重悬于10倍体积Accutase消化液中，置于37℃培养箱消化10分钟，待可见细胞球略微松散时，加入胰酶抑制剂终止消化，采用巴斯德吸管将细胞轻轻吹打分散；500g/min，5分钟，离心收集细胞；4).培养：取出前一天采用神经干细胞条件培养基预处理的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基；将神经干细胞传代培养基与神经干细胞条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶；将传代后的神经干细胞置于37℃细胞培养箱中培养；5).换液：传代3-4天后，进行半量换液：竖立细胞培养瓶2分钟，使神经干细胞球沉降至瓶底，离心管吸出半量培养基之后，加入等量的新鲜神经干细胞传代培养基，换液完毕后放回细胞培养箱继续培养，再将上述吸出的半量培养基收集到离心管中，500g/min离心5分钟，收集上清即可获得神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；6).重复按步骤2)-5)方法进行神经干细胞的传代并培养，建立稳定的神经干细胞系。上述神经干细胞系的建立方法，最后还包括有细胞冻存步骤，所述细胞冻存步骤具体为：细胞传代后7-9天进行细胞冻存，将神经干细胞收集至离心管中，500g离心5分钟，收集细胞；将收集到的细胞重悬于细胞冻存液(DMEM/F12培养基：人白蛋白：二甲基亚砜＝7：2：1)中，冻存密度5×106/ml；将冻存细胞置于异丙醇冻存盒中，-80℃过夜；将细胞转移至液氮罐中长期保存。在建系过程中，观察干细胞标志物及干细胞分化标记的表达。所获得的神经干细胞系呈球状悬浮生长，可以长期稳定增殖超过20代，细胞倍增时间约为3-4天，高表达Nestin、Musashi、CD133、Sox2等神经干细胞标志物。通过本专利技术所述的一种神经干细胞系的建立方法所建立的神经干细胞系，应用于防治脑卒中。本专利技术具有以下有益效果：神经干细胞短期培养相对容易，但建系长期培养却很困难，究其原因是在长时间培养过程中容易产生细胞分化，丧失干细胞特性。本专利技术可以建立稳定的神经干细胞系，进行长期培养获得大量足够研究需求的细胞，同时还能保证细胞的稳定性，尽可能减少研究误差。它在GMP控制条件下进行分离并长期培养，不接触任何动物源性成分，没有致瘤性，可高效表达Nestin、Musashi、CD133、Sox2等神经干细胞标志物。采用条件培养基预处理培养瓶，尽可能降低培养瓶带来的细胞分化问题。如果不采用条件培养基预处理，传代后的神经干细胞容易发生贴壁从而分化的现象，预处理后几乎很少细胞贴壁。神经干细胞系建立在GMP控制下进行，且在培养、冻存过程中不使用任何抗生素及动物源性成分，对细胞未来可能的临床试验研究的安全性保证做到了最大。附图说明图1倒置显微镜观察不同代次神经干细胞球形态；图2神经干细胞干性标记Nestin、Musashi、Sox2、CD133、CD29及分化标记Tuj-1、GFAP、O4流式鉴定图；图3神经干细胞干性标记Nestin、Musashi、CD133及分化标记Tuj-1、GFAP、O4免疫荧光图；图4脑缺血再灌注2h、48h各组动物Longa’s评分情况。其中，干细胞治疗组动物能显著降低Longa’s评分分数，改善动物行为学。means±SEM,n＝15，**p＜0.01vs48h模型对照组；图5TTC染色检测脑缺血再灌注及干细胞治疗48h各组动物脑梗死情况。means±SEM,n＝15，***p＜0.001vs模型对照组；图6脑缺血再灌注28天各组动物脑萎缩情况。means±SEM,n＝13-15，*p＜0.05vs模型对照组；图7脑缺血再灌注28天各组动物脑皮层中段及纹状体病理情况。A，皮层中段；B，纹状体。具体实施方式以下结合附图及实施例对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人成体神经干细胞系的建立，其中包括神经干细胞的培养方法和传代方法两个步骤：/n1).神经干细胞条件培养基来源：当神经干细胞培养3-4天约半数神经球直径超过150μm或培养7-9天约半数神经球直径超过250μm时，吸出半量培养基，加入等量的新鲜培养基，放回细胞培养箱继续培养。将上述吸出的培养基，500G/min离心5分钟，上清即为神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；/n2).细胞培养瓶预处理：取适量神经干细胞条件培养基孵育新的细胞培养瓶8h，备用；/n3).神经干细胞球的消化与传代：培养7-9天、半数神经球直径超过250μm时，500g/min离心5分钟，再将神经干细胞球重悬于Accutase消化液中，置于37℃水浴消化5分钟，超净台机械吹打15-20下，水浴消化3min，加入胰酶抑制剂终止消化，继续吹打15-20下，可见细胞球变小并多为单细胞，500g/min离心5分钟。取出神经干细胞条件培养基预处理过的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基，将神经干细胞基础培养基与条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶，并于CO

【技术特征摘要】
1.一种人成体神经干细胞系的建立，其中包括神经干细胞的培养方法和传代方法两个步骤：
1).神经干细胞条件培养基来源：当神经干细胞培养3-4天约半数神经球直径超过150μm或培养7-9天约半数神经球直径超过250μm时，吸出半量培养基，加入等量的新鲜培养基，放回细胞培养箱继续培养。将上述吸出的培养基，500G/min离心5分钟，上清即为神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；
2).细胞培养瓶预处理：取适量神经干细胞条件培养基孵育新的细胞培养瓶8h，备用；
3).神经干细胞球的消化与传代：培养7-9天、半数神经球直径超过250μm时，500g/min离心5分钟，再将神经干细胞球重悬于Accutase消化液中，置于37℃水浴消化5分钟，超净台机械吹打15-20下，水浴消化3min，加入胰酶抑制剂终止消化，继续吹打15-20下，可见细胞球变小并多为单细胞，500g/min离心5分钟。取出神经干细胞条件培养基预处理过的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基，将神经干细胞基础培养基与条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶，并于CO2细胞培养箱中培养。传代3-4天后，进行半量换液。
4).重复此方法进行神经干细胞的传代和培养，建立稳定的神经干细胞系。


2.根据权利要求1-2任意一项所述的一种神经干细胞系的建立方法，其特征在于，所述神经干细胞培养基由基础培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋修云，安文强，秦娇，刘鹏，汤永永，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11