一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法技术

本发明专利技术设计一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，包含：DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、Glutamax‑I、内皮生长因子、黄体酮、HEPES、NaHCO3。本发明专利技术不含有动物源添加剂，不含有细胞成分，不含有条件培养基，具有如下优点：提供一种无动物源性成分、化学成分明确的干细胞培养基；可以有效保证产品批次的质量问题，有利于标准化，可以很好的支持干细胞的增殖并同时保持其特性，同时悬浮培养的方式也为以后实现干细胞在临床实验批量使用提供保障。

A medium preparation method suitable for large-scale culture of clinical neural stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法
本专利技术涉及一种神经干细胞的培养方法，特别涉及一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法。
技术介绍
神经干细胞是指神经系统中处于较早发育阶段的细胞群体,它们可以通过自身的对称性或不对称性两种分裂方式进行自我复制,产生神经组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞,最终生成具有一定细胞数目和多种细胞类型的神经成神经元和星形胶质细胞及少突胶质细胞等三类细胞。神经干细胞对神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的治疗作用，因此一种临床用大规模培养神经干细胞的培养基具有巨大的应用价值。神经干细胞的培养主要有两种方式:单层培养和神经球悬浮培养。悬浮聚球培养方式可以很好的支持干细胞的增殖并同时保持其特性，同时悬浮培养的方式也为以后实现干细胞在临床实验批量使用成为可能。
技术实现思路
本专利技术提供一种神经干细胞培养基，其可用于人神经干细胞体外长期大量培养扩增。本专利技术还提供一种所述利用神经干细胞培养基进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法培养的细胞性能稳定，并保持较高的干性。本专利技术还提供一种所述利用神经干细胞培养基进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法，该方法能解决临床用干细胞批量生产问题。一种神经干细胞培养基，该神经干细胞培养基包括以下组分：DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、Glutamax-I、内皮生长因子、黄体酮、HEPES、NaHCO3。作为优选，该神经干细胞培养基包括以下体积配比的组分：DMEM/F1298ml，非必需氨基酸1ml，Glutamax-I1ml。作为优选，该神经干细胞培养基中重组人表皮生长因子用量是0.5-1μg。作为优选，该神经干细胞培养基中重组人碱性成纤维细胞生长因子用量是0.5-1μg。作为优选，该神经干细胞培养基中重组人胰岛素用量是1-2.5mg。作为优选，该神经干细胞培养基中氢化可的松用量是100-1000μg。作为优选，该神经干细胞培养基中WNT3a用量是10-50nmol/L。作为优选，该神经干细胞培养基中Notch1用量是10-50nmol/L。作为优选，该神经干细胞培养基中肝素钠用量是10-50μg。作为优选，该神经干细胞培养基中亚硒酸钠用量是5-10μg。作为优选，该神经干细胞培养基中重组人内皮生长因子用量是0.5-2μg。作为优选，该神经干细胞培养基中黄体酮用量是1-2μg。作为优选。该神经干细胞培养基用HEPES和NaHCO3共同维持培养基PH值。作为优选，该神经干细胞培养基的pH值为7.0-7.2。经过研究发现本方法极大的保持细胞活率(>95％)。本专利技术选用商品化的DMEM/F12培养液作为神经干细胞培养的基础培养基；特殊成分的作用机理说明：肝素有下列特殊作用：1)可以与许多种蛋白质结合，增强蛋白质作用；2)促进干细胞增殖作用；3)能够间接抑制神经元，间接地达到抑制神经干细胞分化作用，有利于长期神经干细胞培养。WNT3a；Notch1；胰岛素作用是通过促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，从而促进细胞分裂、生长。氢化可的松促进神经干细胞生长发育；腐胺能够刺激和诱导神经干细胞生长和增殖。亚硒酸钠促进和参与神经干细胞代谢；L-谷氨酰胺可促进神经神经干细胞发育生长期间核酸、蛋白质的合成；人转铁蛋白可结合铁离子，使神经干细胞细胞合理利用铁离子，并减少其对细胞的毒性，并且抑制成纤维细胞生长，有利于神经干细胞增多；黄体酮具有促进神经干细胞生长和调节作用。HEPES和NaHCO3是维持细胞液中酸碱平衡作用。本专利技术提供的的神经干细胞培养基能够使人神经干细胞在体外长期(>30代次)培养扩增，大量扩增后神经干细胞性能稳定；用本专利技术培养的神经干细胞高表达巢蛋白(nestin)、musashi、CD133等神经干细胞表面的特异性标记物；所培养的干细胞可进一步诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。本专利技术很好地解决了人神经干细胞体外培养易分化和难以长期培养扩增的技术难题，从而为临床应用提供来源和标准统一的大量的神经干细胞，此外，本专利技术提供方法配制简单，实验可重复性强，操作简单易行。本专利技术解决了神经干细胞及其临床使用细胞来源问题，使神经干细胞在神经系统损伤和退行性疾病治疗、干细胞定向分化和毒理学、药理学以及其它功能应用成为可能。附图说明图1是培养7天人神经干细胞球显微照片(100倍放大)；图2是培养7天人神经干细胞切片的Nestin荧光标记显微照片(200倍放大)；图3是培养7天人神经干细胞切片的Musashi荧光标记显微照片(200倍放大)；图4是培养7天人神经干细胞切片的CD133荧光标记显微照片(200倍放大)；图5是培养7天人神经干细胞分化后用GFAP抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)；图6是培养7天人神经干细胞分化后用TUJ-1抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)；图7是培养7天人神经干细胞分化后用PDGF抗体荧光标记显示星形胶质细胞图(200倍放大)。；具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1神经干细胞的培养扩增(1)传代扩增方式：采用所述神经干细胞培养基进行培养扩增，细胞瓶置于5％CO2、37℃温度培养箱中进行培养，根据细胞增殖情况，每3-4天半量更换神经干细胞培养基一次；神经干细胞在神经干细胞培养基中连续培养，当大部分神经干细胞的干细胞球直径为500-700微米时，利用Accutase37℃消化神经球成单细胞，经离心后去除，并加入一半新配制的神经干细胞培养基和另一半使用后的神经干细胞培养基互相混合，按1:2或1:4比例分瓶传代继续培养。按这种传代扩增方式可以使人神经干细胞连续培养扩增30代次以上。实施例2神经干细胞球切片及标记蛋白鉴定①观察细胞球，选取直径200-300um(约培养4天)的神经球一瓶，分装至3个50ml离心管内，自沉降后吸弃上清，速冻后用O.C.T包埋；②设置切片机箱体-21℃，样品头-21℃—-19℃切片，厚度为4.5um；③将切片置于60烘箱过夜；④取出切片置于-20℃冻存待用；⑤冰冻切片室温丙酮(冷丙酮)固定10min，PBS洗10min×3；⑥缓冲液漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的DPBS(含0.1％TritonX-100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基包括以下组分：DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、Glutamax-I、内皮生长因子、黄体酮、HEPES、NaHCO3。/n

【技术特征摘要】
1.一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基包括以下组分：DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、Glutamax-I、内皮生长因子、黄体酮、HEPES、NaHCO3。


2.根据权利要求1所述的适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基包括以下体积配比的组分：DMEM/F1298ml，非必需氨基酸1ml，Glutamax-I1ml。


3.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该干细胞培养基中重组人表皮生长因子用量是0.5-1μg。


4.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中重组人碱性成纤维细胞生长因子用量是0.5-1μg。


5.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中重组人胰岛素用量是1-2.5mg。


6.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中氢化可的松用量是100-1000μg。


7.根据权利要求1所述的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，其特征在于，该神经干细胞培养基中WN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿，秦娇，安文强，汤永永，赵成，闫红，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11