重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞及皮层神经元中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种神经干细胞的制备方法及应用，本发明专利技术通过加入Notch信号通路受体Notch1的方法解决神经干细胞高效扩增的问题，可以获得功能稳定且活性高的神经干细胞，可进一步分化为数量大的皮层功能神经元，为皮层功能神经元的获得奠定了基础，可以满足同时筛选多种药物的目的。

【技术实现步骤摘要】
重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞及皮层神经元中的应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞及皮层神经元中的应用。
技术介绍
脑卒中是由于脑血管阻塞或是破裂导致脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其死亡率位居全球第二位，也是中国成年人残疾的首要原因。其中，缺血性脑卒中的发病率较高，占脑卒中总数的60-70％。目前，缺血性脑卒中的急性期治疗为应用溶栓药物重组人组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)，但该药的应用有严格的时间限制，为发病4.5小时之内，而且其引起的继发性颅内出血的副作用也限制了它的应用，所以，找寻新的神经保护药物成为当务之急。近20年，科学家在不停的研发新的药物，但在动物实验中有效的药物而临床试验却失败了，究其原因，实验动物和人类对药物的反应还是有很大区别。随着人诱导性多能干细胞(iPSCs)的建立，新的疾病模型也随之产生，由于来源于正常人或病人，iPSCs建立的模型更接近于人本身的特性，利用人iPSCs诱导来的皮层神经元进行药物筛选既避免了伦理问题又大大提高了药物转化效率。皮层神经元从iPSCs分化的第一步是神经诱导以产生神经干细胞(NSC)，最常用的方法为通过双SMAD抑制，即BMP拮抗剂Noggin和TGF-β信号传导的小分子抑制SB431542，促进神经外胚层分化。通过该方法形成的神经干细胞需经多次传代而进一步纯化、扩增，待细胞稳定后再行神经诱导为皮层神经元。研究表明，表皮生长因子(EGF)及成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)对于维持神经干细胞的稳定增殖至关重要，另外，添加WNT信号传导拮抗剂DKK1也可以增强神经干细胞的衍生。目前，常用的神经干细胞维持培养基为Neurobasal培养基+1×N2+1×B27+EGF(10ng/ml)+FGF-2(10ng/ml)+脑源性生长因子(BDNF，20ng/ml)。但在这种培养条件下的神经干细胞仍然增殖缓慢，不能在短时间内获得功能稳定且数量高的神经干细胞，影响了下一步神经元的诱导。McCaughey-Chapman统计了常用的诱导方法指出iPSCs技术的主要缺点是该策略的效率低，其中通常少于1％的细胞经历iPSCs的诱导成为神经细胞。目前已利用人iPSCs诱导为神经干细胞，然后进行神经干细胞的扩增，之后再诱导为皮层神经元来进行脑卒中神经保护药物筛选。在此过程中，神经干细胞的稳定衍生最为关键，决定诱导分化神经元的效率及活性，对药物效果的鉴定，起到至关重要的作用，因此，高效筛选高活性神经干细胞的方法决定了药物筛选的成败。中国文献《Notch1信号通路对人牙周膜干细胞应力分化过程的调控》(周述作，秦凡，崔嘉玺等，局解手术学杂志，2017，26(4))，该文献中表述了Notch1是Notch家族在人类体内最重要的受体之一，属于I型跨膜蛋白，该文献通过激动剂人重组Jagged1蛋白，抑制剂γ外分泌酶抑制剂(DAPT)上、下调Notch1通路关键蛋白(NICD)，研究动态张应力作用下Notch1信号通路参与人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨的作用。文献《人胚胎神经干细胞向神经元分化过程中Notch1基因的表达》(王飞，李世亭，黄强等，细胞与分子免疫学杂志，2004：6)中，随着NSC向神经元的分化，Notch1的表达量逐渐减少，提示Notch1在NSC向神经元分化的过程中可能主要起负调控作用，也说明Notch信号通路可能在维持人胚胎神经干细胞自我增殖中发挥正向调控作用。由人源iPSCs诱导来的神经干细胞与人牙周膜干细胞和人胚胎神经干细胞均存在显著差异。人牙周膜干细胞属于人间充质干细胞，其来源于外胚层间充质，可进一步分化为成骨细胞和脂肪细胞；而神经干细胞来源于外胚层，进一步分化为神经元和胶质细胞。文献《Single-cellstudyofneuralstemcellsderivedfromhumaniPSCsrevealsdistinctprogenitorpopulationswithneurogenicandgliogenicpotential》(MattiLam，TsukasaSanosaka，AndersLundin，etal.，GenestoCells，2019：24)中，对由人iPSCs诱导来的神经干细胞及原代培养的人胚胎干细胞进行了单细胞测序，虽然两者都存在向神经和胶质分化的潜质，但两者的基因型还是存在很大的差距。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞及皮层神经元中的应用。目前，由iPSCs向神经元诱导分化常用的方法分为两个阶段，第一阶段为iPSCs诱导分化为神经干细胞，第二阶段为神经干细胞诱导分化为神经元。如若想获得大量的神经元用于下一步的研究，就需要有数量大并且可以稳定增殖的神经干细胞，但应用目前的添加生长因子的方法，在传代过程中，神经干细胞的数量随着传代次数的增加反而减少，且增殖缓慢，这种现象考虑神经干细胞活性降低导致。本专利技术通过改良第一阶段神经干细胞维持培养基，加入Notch信号通路受体Notch1的方法来增加神经干细胞活性，缩短了神经干细胞的增殖周期，稳定传代，后期可获得大量有功能的皮层神经元。本专利技术通过加入Notch信号通路受体Notch1的方法解决神经干细胞高效扩增的问题，可以获得功能稳定且活性高的神经干细胞，可进一步分化为数量大的皮层功能神经元，为皮层功能神经元的获得奠定了基础，可以满足同时筛选多种药物的目的。本专利技术的技术方案：重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞中的应用。所述神经干细胞为能够分化为具有产生动作电位功能的皮层神经元的神经干细胞。重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞中的应用，具体涉及上述神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)当人源iPSCs细胞汇合度达到100％以上时开始利用神经干细胞诱导培养基进行神经干细胞诱导分化培养4-6天，停止诱导，然后进行消化，收集细胞；(2)步骤(1)中收集的细胞，用神经干细胞维持培养基重悬细胞继续培养4-7天后进行消化传代；获得神经干细胞，所述神经干细胞维持培养基组分中包括重组人Notch1蛋白。根据本专利技术优选的，步骤(1)中神经干细胞诱导培养基为：Neurobasal培养基+1×N2+1×B27+1×GlutaMAX-I+500ng/ml人重组Noggin+20μMSB431542+4ng/mlFGF-2。根据本专利技术优选的，步骤(1)中的诱导分化培养过程中，每3天进行半量换液。所述步骤(1)中诱导分化培养4-6天至在显微镜下可观察到多个散在的Rosette(凸起状)结构，停止诱导。根据本专利技术优选的，步骤(1)中用胰酶进行消化，收集细胞。进一步优选的，步骤(1)中用0.25％Trpsin-EDTA进行消化。根据本专利技术优选的，步骤(2)中培养基组分中重组人Notch1蛋白的质量浓度为90-110ng/ml。进一步优选的，步骤(2)中神经干细胞维持培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞中的应用。


2.如权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述神经干细胞为能够分化为具有产生动作电位功能的皮层神经元的神经干细胞。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，具体涉及所述神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)当人源iPSCs细胞汇合度达到100％以上时开始利用神经干细胞诱导培养基进行神经干细胞诱导分化培养4-6天，停止诱导，然后进行消化，收集细胞；
(2)步骤(1)中收集的细胞，用神经干细胞维持培养基重悬细胞继续培养4-7天后进行消化传代；获得神经干细胞，所述神经干细胞维持培养基组分中包括重组人Notch1蛋白。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中神经干细胞诱导培养基为：Neurobasal培养基+1×N2+1×B27+1×GlutaMAX-I+500ng/ml人重组Noggin+20μMSB431542+4ng/mlFGF-2；
优选的，步骤(1)中的诱导分化培养过程中，每3天进行半量换液；
优选的，步骤(1)中用胰酶进行消化，收集细胞；
优选的，步骤(1)中用0.25％Trpsin-EDTA进行消化。


5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中神经干细胞维持培养基组分中重组人Notch1蛋白的质量浓度为90-110ng/ml；
优先的，步骤(2)中神经干细胞维持培养基为：Neurobasal培养基+1×N2+1×B27+10ng/mlEGF+10ng/mlFGF-2+20ng/mlBDNF+100ng/ml重组人Notch1蛋白；
优选的，步骤(2)中继续培养过程中，每3天进行半量换液；
优选的，步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨潘，朱玮，王琳娜，李慧，
申请(专利权)人：青岛海尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37