银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法技术

本发明专利技术公开了一种银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球，然后，进行神经干细胞分化培养，在分化培养液中加入IL‑1α和银杏内酯。本发明专利技术的方法可以有效提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化细胞成熟度。

【技术实现步骤摘要】
银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法
本专利技术涉及细胞研究领域，特别涉及一种细胞分化方法。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sDisease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其基本病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死，数量减少，致使纹状体内多巴胺神经递质释放减少，从而产生震颤、肌肉强直等一系列运动障碍症状。传统的药物治疗和外科治疗仅限于改善症状，但并不能阻止病情发展，不能从根本上解决问题。由于此病变主要侵犯中脑黑质多巴胺能神经元，且黑质多巴胺能神经元投射的靶区纹状体定位明确，所以在黑质-纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的神经元，恢复多巴胺的神经环路是一个针对病因治疗的理想方法。胚脑组织或细胞移植虽然可以有效地修复因神经元退变而受损的脑组织，但因移植组织来源有限、异体免疫排斥反应及伦理等问题的困扰，在实际应用上受到了很大的限制。神经干细胞(NeuralStemCells,NSCs)由于其固有的增殖能力，在体外培养中能够无限增殖而达到所需数量以及神经干细胞的多分化潜能等特性，从而为细胞移植治疗PD开辟了广阔的新天地。然而，研究表明体外培养的NSCs一般情况下大多分化为胶质细胞，很少分化为神经元，特别是特异性的多巴胺能神经元，这给临床应用NSCs移植治疗PD造成了极大的障碍。神经干细胞分化为何种类型的神经细胞，不仅取决于内在的基因调控，更受到外在环境中包括特异性细胞因子在内的微环境的影响。国外学者通过18种细胞因子诱导大鼠神经干细胞定向分化作用的筛选，发现只有IL-1α和IL-1β能够诱导中脑来源的神经干细胞向酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)阳性神经元分化，而IL-11、LIF和GDNF本身没有明显的诱导分化作用，但却能明显地提高TH阳性多巴胺能神经元的存活率。TH是细胞内酪氨酸合成多巴胺过程中的限速酶，通常作为多巴胺能神经元的特异性标志，其表达情况是NSCs能否转化为多巴胺能神经元的关键。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的神经干细胞向神经元分化的细胞成熟度底下的问题，本专利技术提供了一种银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化细胞成熟度的方法，本专利技术的技术方案为：一种银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球，然后，进行神经干细胞分化培养，在分化培养液中加入IL-1α和银杏内酯。所述的银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，具体步骤为：第一步，制备亚细胞系克隆球：通过分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球；第二步，接种培养：采用多孔板对亚细胞系克隆球进行神经元分化培养；第三步，固定、封闭非特异性抗原：培养3周后，固定并封闭非特异性抗原。所述的IL-1α在分化培养液中的终浓度为50-150pg/ml。所述的分化培养液中银杏内酯的终浓度为30-50μg/ml。所述的分化培养液为胎牛血清分化培养液。所述的分化培养液的组成为：DMEM/F12加Hepes、NaHCO2、10％FBS和青霉素、链霉素。DMEM/F12的比例为1：1。分化培养环境为37℃，5％CO2培养箱。固定是采用甲醇和多聚甲醛进行固定。有益效果银杏内酯在神经系统内可拮抗氧自由基对神经元的损伤作用，提高神经元钙离子缓冲能力，而双向调节细胞内钙平衡，增强细胞膜的稳定性，从而拮抗多种因素对神经元的损害。另外，银杏内酯还可以阻断β-淀粉样蛋白所致的神经元凋亡。本专利技术在银杏内酯组的分化培养液中，同时加入了IL-1α和银杏内酯，结果发现TH阳性多巴胺能神经元的分化率为6.61±0.78％，比单用IL-1α者略有增加，但神经元在形态上要成熟得多，特别是突起较多较长，说明银杏内酯对诱导神经干细胞向多巴胺能神经元定向分化的作用甚微，但却对多巴胺能神经元的成熟尤其是突起的发育具有促进作用。附图说明图1为对照组接种1天后细胞分化情况，示细胞从神经球的边缘向外迁移，细胞的突起粗短×100。图2为对照组接种7天后细胞分化情况，示细胞扁平无光晕的胶质样细胞a和胞体圆形或椭圆形有较强光晕的神经元样细胞b×100。图3为银杏内酯组接种7天后细胞分化情况，示神经元样细胞数量较多，且突起较长×100。图4为对照组接种14天后细胞分化情况，示神经元样细胞少，胞体较小，突起较少×100。图5为IL-1a组接种14天后细胞分化情况，示神经元样细胞较多，但胞体较小，突起较少较短×100。图6为银杏内酯组接种14天后细胞分化情况，示神经元样细胞较多，胞体较大，突起最多，相互交织成网状×100。图7为对照组TH和MAP-2免疫荧光双标染色a.TH阳性多巴胺能神经元b.MAP-2阳性神经元c.TH和MAP-2双阳性神经元×200。图8为IL-1α组TH和MAP-2免疫荧光双标染色a.TH阳性多巴胺能神经元b.MAP-2阳性神经元c.TH和MAP-2双阳性神经元×200。图9为银杏内酯组TH和MAP-2免疫荧光双标染色a.TH阳性多巴胺能神经元b.MAP-2阳性神经元c.TH和MAP-2双阳性神经元×200。具体实施方式一、实验材料和技术方法(一)细胞及试剂1.单细胞克隆球：用无血清培养技术和单细胞克隆技术从3～4月龄的人胚胎中脑组织中分离、克隆、增殖而得到大量来源于同一细胞的亚细胞系克隆球；2.诱导分化主要试剂：DMEM培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium，Cat.No.12100-038)，F12培养基(F12NutrientMixture，Cat.No.21700-026)，胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS，Cat.No.16140-087)均购自Gibco公司。白细胞介素1α(Interleukin-1α,IL-1α，Cat.No.I2778)购自Sigma公司；银杏内酯(Ginkgolide)购自中国药科大学。3.抗体及荧光试剂：小鼠抗微管相关蛋白-2单克隆抗体(MouseAnti-MAP-2MonoclonalAntibody，Cat.No.MAB3418)，兔抗酪氨酸羟化酶多克隆抗体(RabbitAnti-TyrosineHydroxylasePolyclonalAntibody，Cat.No.AB151)均购自Chemicon公司。结合有FITC的山羊抗小鼠IgG(二抗)(GoatAnti-MouseIgGFITCConjugate，Cat.No.F4018)，结合有TRITC的山羊抗兔IgG(二抗)(GoatAnti-RabbitIgGTRITCConjugate，Cat.No.T5268)均购自Sigma公司。(二)人神经干细胞的体外定向诱导分化1.分组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，其特征在于，分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球，然后，进行神经干细胞分化培养，在分化培养液中加入IL-1α和银杏内酯。/n

【技术特征摘要】
1.一种银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，其特征在于，分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球，然后，进行神经干细胞分化培养，在分化培养液中加入IL-1α和银杏内酯。


2.如权利要求1所述的银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步，制备亚细胞系克隆球：通过分离、克隆、增殖得到来源于同一神经干细胞的亚细胞系克隆球；
第二步，接种培养：采用多孔板对亚细胞系克隆球进行神经元分化培养；
第三步，固定、封闭非特异性抗原：培养3周后，固定并封闭非特异性抗原。


3.如权利要求1或2所述的银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，其特征在于，所述的IL-1α在分化培养液中的终浓度为50-150pg/ml。


4.如权利要求1所述的银杏内酯提高诱导神经干细胞向TH阳性神经元分化成熟度的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭雪锋，田美玲，秦建兵，金国华，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32