一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法技术

本发明专利技术公开了一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，包括以下步骤：1)采用Serb Resin树脂制备氨基酸树脂Fmoc‑AA‑NH

【技术实现步骤摘要】
一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法
本专利技术属于药物合成方法
，涉及一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法。
技术介绍
二硫键是由两个巯基(SH)氧化而成的一类环状化合物结构，是多肽化合物中，常见的一种结构形式。例如已上市多肽药物：缩宫素、去氨加压素、精氨酸加压素、赖氨酸加压素、特利加压素、兰瑞肽等等。该类多肽产品的合成方法主要有两大类，一类是液相合成；另一类是固相合成。其中液相合成的策略主要是采用片段缩合法，即合成不同片段，再片段缩合；比如十肽化合物精氨酸加压素采用“4+6”、“5+5”、“3+7”等策略。最后再进行氧化成环。而固相合成的策略主要是针对保护基策略和脱保护方法。比如精氨酸加压素常用的策略有先合成全保护肽，再进行切割得到线性肽，最后再通过氧化剂氧化等方式得到二硫的精氨酸加压素。具体到该类化合物的二硫键形成，主要也有两大类：即液相氧化和固相氧化。多肽二硫键的固相氧化，通常步骤是：Fmoc固相合成策略合成多肽，然后采用一定量的碘进行氧化成环，再进行裂解，沉淀制备得到目标肽。液相氧化大致过程是：固相合成多肽，然后裂解得到线性肽(不带保护基的肽)，然后将线性肽溶解在水-乙腈等溶液体系，为防止分子间二聚等，通常采用较低浓度的体系，加入氧化剂(碘、氧气、双氧水等)进行氧化成环，然后浓缩，制备得到目标肽。以上方法是多肽化合物形成二硫键的常用方法。液相片段缩合存在合成周期长，合成操作繁琐，后处理纯化等比较复杂，粗肽纯度低且需用到氢溴酸等强酸，不易放大生产，该方案已逐渐被多肽领域淘汰。现今，Fmoc策略成为多肽合成中的主流策略。这类多肽按照氧化的形式又分为固相氧化和液相氧化。液相氧化工艺大致如下：先固相合成肽树脂，然后在强酸体系下裂解(10倍体积的95％TFA)，再制备得到线性肽，最后在极稀的浓度下进行氧化(一般在1mg/ml，甚至0.5mg/ml)，最后在较大的反应液体积的情况下二次制备，得到目标化合物。该方法是现阶段常规的精氨酸加压素类多肽(精氨酸加压素、缩宫素、特利加压素等含有一对二硫键的多肽)的合成方案；该方案显而易见的缺点是：整个实验过程繁琐，需要两次制备纯化，且在线性肽氧化时，需要较大体积的溶剂溶解(防止二聚体产生，要求反应浓度极稀)，因此在氧化后的纯化工作时，大量溶剂的分离给纯化工作带来较大的工作量，且存在三废处理麻烦，两步纯化的总收率较低等等问题。固相氧化工艺大致如下：选用Trt或者Mmt保护巯基。采用Fmoc固相合成策略合成肽树脂，然后采用10-15倍当量的碘/DCM溶剂，一起在柱子中氧化1小时，反应毕抽干树脂，然后采用强酸(10倍体积的三氟乙酸)裂解肽树脂，10倍体积的乙醚沉淀，制备，得到目标化合物。该方法操作简便，但是因为在固相树脂中进行氧化，需要大量的碘(一般采用10-15倍当量的碘)，反应才能完全氧化成环，在精氨酸加压素、缩宫素、去氨加压素等多肽肽序中含有Tyr等易氧化基团，因此采用该方案进行固相氧化，杂质多，粗肽纯度低。再者以上无论固相氧化还是液相氧化，均需要采用高浓度强酸(一般95％的三氟乙酸)进行树脂的裂解和保护基脱除。我们试图开发一种新的合成工艺来解决以上：操作繁琐，粗肽纯度低，总收率低等一系列问题，同时避免使用三氟乙酸等强酸造成三废问题，已达到绿色环保的目的。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，包括以下步骤：1)采用SerbResin树脂制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-SerbResin，然后采用特定的弱酸敏感的保护基Fmoc氨基酸，合成肽树脂；2)树脂裂解，同时形成二硫键；3)沉淀得到粗肽。进一步地，所述含一对二硫键的多肽为肽序中的氨基酸侧链保护基可以是采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液脱离或氨基酸不需要保护，且在合成过程中不宜发生副反应的一类多肽。进一步地，所述步骤1)为采用SerbResin树脂为合成起点，制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-SerbResin，然后根据多肽固相合成法，按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸合成多肽树脂，其中多肽树脂中引入的Cys采用的原料为Fmoc-Cys(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Arg，则引入Arg采用的原料为Fmoc-Arg(HCl)-OH，若多肽树脂中含有His，则引入His采用的原料为Fmoc-His(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Tyr，则引入Tyr采用的原料为Fmoc-Tyr-OH，若多肽树脂中含有Asn，则引入Asn采用的原料为Fmoc-Asn-OH，若多肽树脂中含有Gln，则引入Gln采用的原料为Fmoc-Gln-OH(Tyr侧链的酚羟基和Asn、Gln侧链的酰胺，均较为稳定，不宜发生副反应)。例如精氨酸加压素的合成：先合成氨基酸树脂Fmoc-Gly-NH2-SerbResin，再选择Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH等合成肽树脂NH2-Cys(Mmt)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Mmt)-Pro-Arg(HCl)-Gly-NH2-SerbResin。进一步地，所述步骤2)为采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液裂解树脂，然后滴加重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液。进一步地，所述步骤2)为采用肽树脂重量的8-10倍体积的TFE的DCM溶液(即相对于树脂重量采用的溶剂为8ml/g-10ml/g)，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液裂解树脂2-3小时后，滴加等体积的重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液，继续搅拌15-35分钟。(前2-3小时为裂解步骤，后15-35分钟为氧化步骤，均相状态碘氧化充分，且酸性条件下有利于氧化。需要碘量较低，副反应较少。)进一步地，所述步骤3)为室温浓缩混合液至1/2体积，采用裂解液8-10倍体积的乙醚沉淀，得到粗肽。进一步地，所述弱酸敏感的保护基为在体积百分数为1-5％的TFA的DCM溶液或者TFE与DCM的体积比为1：4的TFE的DCM溶液中能脱离的弱酸性保护基，优选为Mmt。进一步地，所述SerbResin树脂的替代度为0.4-0.7mmol/g。进一步地，所述粗肽的合成步骤后还包括纯化步骤；所述纯化步骤以高压液相色谱法进行纯化。本专利技术的有益效果是：1、采用SerbResin树脂和本专利技术的保护氨基酸组合，这样避免使用高浓度的TFA裂解，同时可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)采用Serb Resin树脂制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH

【技术特征摘要】
1.一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用SerbResin树脂制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-SerbResin，然后采用特定的弱酸敏感的保护基Fmoc氨基酸，合成肽树脂；
2)树脂裂解，同时形成二硫键；
3)沉淀得到粗肽。


2.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述含一对二硫键的多肽为肽序中的氨基酸侧链保护基可以是采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液脱离或氨基酸不需要保护，且在合成过程中不宜发生副反应的一类多肽。


3.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述步骤1)为采用SerbResin树脂为合成起点，制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-SerbResin，然后根据多肽固相合成法，按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸合成多肽树脂，其中多肽树脂中引入的Cys采用的原料为Fmoc-Cys(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Arg，则引入Arg采用的原料为Fmoc-Arg(HCl)-OH，若多肽树脂中含有His，则引入His采用的原料为Fmoc-His(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Tyr，则引入Tyr采用的原料为Fmoc-Tyr-OH，若多肽树脂中含有Asn，则引入Asn采用的原料为Fmoc-Asn-OH，若多肽树脂中含有Gln，则引入Gln采用的原料为Fmoc-Gln-OH。


4.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧星，熊战魁，尹传龙，陶安进，余品香，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，翰宇药业武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44