二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组制造技术

本发明专利技术公开了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测引物组，包括引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列，其中引物7和引物8为Taqman探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与MDV meq基因区分疫苗株和强毒株的差异位点结合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV疫苗株和强毒株。据此，发明专利技术人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。总之，本发明专利技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组


[0001]本专利技术属于病毒检测
，尤其涉及一种二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组。

技术介绍

[0002]马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的以感染鸡、火鸡为主的一种致肿瘤的传染病。尽管MDV只有一个血清型，但是不同毒株之间的生物学特性存在明显差异。疫苗株不致瘤，属于弱毒株，而已报道分离到的野毒株绝大多数为强毒株，具有致瘤特性。目前区分MDV的疫苗株和强毒株的分子标记主要以meq基因的576
‑
578位点为主。
[0003]传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplimeqication，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，在一些病原微生物的检测中已被广泛运用。传统的LAMP检测方法中，创新性地加入taqman探针，反应时特异性的taqman探针会与扩增产物杂合并随着扩增进行过程水解，发出荧光。
[0004]经查，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株可视化检测试剂盒和方法的相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测引物组，包括引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。
[0008]引物7和引物8为taqman探针，引物7在5
’
端和3
’
端分别标记5
‑
FAM荧光基团和淬灭基团BHQ
‑
1，引物8在5
’
端和3
’
端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ
‑
3。
[0009]引物1至引物8的摩尔比为8:8:1:1:4:4:1:1。
[0010]上述检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
[0011]环介导等温扩增的条件为68℃反应60min，80℃作用5min灭活。
[0012]二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒，包括引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。
[0013]引物7和引物8为taqman探针，引物7在5
’
端和3
’
端分别标记5
‑
MEQAM荧光基团和淬灭基团BHQ
‑
1，引物8在5
’
端和3
’
端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ
‑
3。
[0014]上述检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
[0015]引物1至引物8在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、0.2μmol/L和0.2μmol/L。
[0016]针对目前MDV疫苗株和强毒株检测存在的问题，专利技术人根据MDV的保守序列针对6个特异区域设计了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测引物组，包括引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列，其中引物7和引物8为FENZI它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与MDV meq基因的区分强弱毒的位点杂合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物7与强毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出绿色荧光；引物8与弱毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV疫苗株和强毒株。
[0017]据此，通过优化反应体系和条件，专利技术人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。该法只需要在68℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测MDV，并且通过荧光区分强弱毒株，反应后，发出绿色荧光的为强毒株，发出红色荧光的为弱毒疫苗株，若样品中同时存在强毒株和疫苗株，则为黄色荧光。试验证实，本专利技术检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的MDV DNA样品。
[0018]本专利技术只需要用1套引物，即可扩增所有的MDV meq基因，并通过针对区分强弱毒株的meq基因576
‑
578位点特异序列的taqman探针只分别与弱毒疫苗株和强毒株序列杂合，反应过程中杂合探针水解释放游离荧光基团。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过taqman杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响，克服了现有技术中不能区分弱毒疫苗株和强毒株或引物二聚体导致假阳性的问题。
[0019]总之，本专利技术具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
附图说明
[0020]图1是本专利技术LAMP方法检测MDV强弱毒的特异性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP特异性试验扩增曲线，B为荧光成像仪观测的LAMP特异性试验扩增结果；其中，1为MDV疫苗株，2为MDV强毒株，3为MDV疫苗株和强毒株混合，4为禽白血病病毒，5为网状内皮增生症病毒，6为传染性法氏囊炎病毒，7为鸡传染性贫血病毒，8为阴性对照(水)。
[0021]图2是本专利技术LAMP方法检测MDV强弱毒的敏感性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增曲线，MDV疫苗株和强毒株的模板1:1等量加入反应(浓度为总浓度)；B为荧光成像仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增结果，第一排为MDV疫苗株，第二排为MDV强毒株，第三排为疫苗株和强毒株1:1等量(浓度为总浓度)。其中，1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照。
[0022]图3是本专利技术LAMP方法随机检测临床分离MDV毒株和疫苗株的结果图，图中：1
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7为随机检测的7份样品，8为阴性对照。
0.2μmol/L、MDV
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LF 0.8μmol/L、MDV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测引物组，其特征在于包括引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物7和引物8为taqman探针，引物7在5
’
端和3
’
端分别标记5
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FAM荧光基团和淬灭基团BHQ
‑
1，引物8在5
’
端和3
’
端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ
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3。3.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物8的摩尔比为8:8:1:1:4:4:1:1。4.权利要求1所述的检测引物组在环介导等温扩增中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述环介导等温扩增的条件为68℃反应60min，80℃作用5min灭活。6.二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒，其特征在于包括引...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书五页序列表二页附图二页，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：