一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）血清型鉴定的RT

【技术实现步骤摘要】
一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于兽医传染病检测
，具体涉及一种BTV血清型的一步法RT-PCR鉴定方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种通过吸血库蠓(Culicoides spp.)叮咬易感动物传播的烈性出血性虫媒病毒病，其病原为蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)。BT呈世界范围分布，非洲、北美洲、南美洲、大洋洲与亚洲的热带、亚热带与温带地区均有疫病的爆发。BTV可感染几乎所有的反刍动物，牛和山羊感染病毒后，往往无明显的临床症状，成为病毒的储存宿主与传播源。易感绵羊感染BTV后可出现明显的蓝舌病临床症状，表现为高热、消瘦、口唇充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等。当新血清型BTV传入时，感染绵羊的发病率可达80％，死亡率高达40％，给养殖业带来毁灭性的灾难。世界动物卫生组织(Office international des
é
pizooties，OIE)将BT列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。
[0003]BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，目前已在世界范围确认了27种BTV血清型(BTV-1～BTV-27)。BTV基因组大小约20kb，由10个节段(Seg-1～Seg-10)的双链RNA(dsRNA)组成。Sge-2编码的VP2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白之一，与病毒感染早期对细胞的吸附和侵入有关，诱导机体产生针对特定血清型BTV的中和抗体，决定着BTV的血清型。BTV的Seg-2/VP2序列具有高度变异的特性，不同血清型BTV毒株之间Seg-2核苷酸序列差异在38.6％～59.5％之间，VP2蛋白的氨基酸序列的差异在40.5％～72.9％之间。根据Seg-2的变异，可将27个血清型的BTV分为A-L等12种基因群。研究发现，同一种血清型BTV的Seg-2/VP2序列差异度可达31.6％/27.4％，可根据这种差异将同一种血清型BTV的Seg-2分为“东方型”(Eastern)和“西方型”(Western)两种地域型。
[0004]1979年在我国云南省师宗县爆发BT的发病绵羊上首次分离并确认了BTV在我国的存在。1996年至1997年，申请人在我国云南省设立的哨兵牛中分离出7种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16)。2012年以来，专利技术人在全国范围开展了BTV流行病学调查，在我国的云南、广西、广东、江苏与湖南相继分离出了12种血清型的BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)300余株。多种BTV血清型在我国的流行，不同血清型BTV诱导的中和抗体无明显的交叉保护，给我国BT的防控带来了严峻的挑战。对流行BTV的血清型进行快速准确的鉴定，是确保BTV流行病学研究顺利开展，科学制定BT防控策略的首要前提。
[0005]血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)是鉴定BTV血清型的经典方法，但该方法存在费时、费力以及实验成本高等缺陷，主要体现在以下四个方面：(1)需准备细胞、细胞培养基、胎牛血清、细胞瓶和细胞培养96孔板；(2)需准备24个血清型BTV(BTV-1至BTV-24)标准参考病毒，制备各个血清型病毒的标准阳性血清；(3)完成中和试验一般需要2周的时间，不利于病毒血清型的快速鉴定；(4)自然界中，几种血清型BTV感染同一个宿主动
物的情况十分普遍，通过血清中和试验进行病毒的血清型鉴定，往往存在对其它血清型BTV漏检的可能性。鉴于血清中和试验在鉴定BTV血清型上的不足，亟需开发一种快速、成本低廉、准确的BTV血清型诊断方法。

技术实现思路

[0006]为解决BTV血清型鉴定现有技术的不足，本专利技术提供了一种BTV血清型鉴定RT-PCR试剂盒。本专利技术根据我国流行的BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24等12种血清型毒株的Seg-2序列特性，选择每种血清型Seg-2序列高度保守区域设计出12对血清型特异性RT-PCR引物并制备试剂盒。该试剂盒克服了传统血清中和试验耗时长、过程繁琐、实验成本高等方面的不足，具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，填补了国内尚无BTV血清型的RT-PCR检测试剂盒的空白。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]1.蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒
[0009]本专利技术第一方面提供一种BTV血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒，包括用于特异性扩增12种血清型的BTV毒株Seg-2基因序列的引物对组合，其中，所述12种血清型的BTV分别为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24。
[0010]在本专利技术的一些具体实施方案中，
[0011]用于特异性扩增BTV-1型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
[0012]用于特异性扩增BTV-2型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
[0013]用于特异性扩增BTV-3型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
[0014]用于特异性扩增BTV-4型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
[0015]用于特异性扩增BTV-5型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；
[0016]用于特异性扩增BTV-7型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
[0017]用于特异性扩增BTV-9型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
[0018]用于特异性扩增BTV-12型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；
[0019]用于特异性扩增BTV-15型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；
[0020]用于特异性扩增BTV-16型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；
[0021]用于特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括用于特异性扩增12种血清型的BTV毒株Seg-2基因序列的引物对组合，其中，所述12种血清型的BTV毒株分别为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24。2.根据权利要求1所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于特异性扩增BTV-1型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-2型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-3型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-4型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-5型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-7型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-9型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-12型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-15型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-16型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 19和SEQ ID No. 20所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-21型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨恒，李占鸿，廖德芳，李卓然，杨振兴，李华春，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：