引物组、试剂盒、区分不同IBV疫苗毒株的多重PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种引物组、试剂盒、区分不同IBV疫苗毒株的多重PCR检测方法及其应用，区分不同IBV疫苗毒株的多重PCR检测方法包括如下步骤：根据H120型IBV、4/91型IBV、QX型IBV以及LDT3型IBV的核苷酸序列分别设计特异性引物组；核酸提取、cDNA的合成及重组质粒的制备；建立单重PCR扩增反应体系；建立多重PCR扩增反应体系；特异性好，检测速度快，灵敏度高，具有良好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
引物组、试剂盒、区分不同IBV疫苗毒株的多重PCR检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及引物组、试剂盒、区分不同IBV疫苗毒株的多重PCR检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性高传染性疾病。IBV主要侵害雏鸡呼吸道，引起咳嗽、打喷嚏、张口呼吸和气管啰音等呼吸道症状，在破坏呼吸道黏膜完整性后还可促进其它条件性致病菌如大肠杆菌、支原体等继发性感染而提高鸡群死亡率。目前，IB弱毒疫苗是我国预防IB所应用最为广泛的手段，市场上使用的弱毒疫苗毒株有3种，分别为LDT3型、H120型和QX型，另外还有一种国外常用的疫苗株4/91，在我国并未批准使用，但在我国多个地方发现了新型变异的4/91型毒株，可能与4/91毒株的违规使用有关。4种疫苗对不同的IBV基因型具有不同的保护力，根据不同养殖场发病情况选择合适的IBV疫苗是IB防控的关键。由于IBV特殊的基因结构导致病毒复制时极易出错，当两种或两种以上的IBV毒株共感染宿主时，增加了病毒重组变异的风险。IBV弱毒疫苗中只能含有1种毒株，然而研究发现目前部分IBV商品化疫苗虽然被批准仅能够含有1种IBV毒株，但通常含有2种甚至3种IBV毒株，以增加疫苗对IB的交叉保护效果；包含多个毒株的IBV弱毒疫苗的广泛使用导致IBV重组毒株的流行。因此，急需一种鉴定疫苗中LDT3型、H120型、4/91型和QX型的方法，以期对疫苗毒株的鉴定及临床使用提供参考。

技术实现思路

[0003]针对现有的IBV疫苗中可能存在的多种IBV毒株，导致IBV重组毒株的流行的问题，本专利技术提供一种引物组。
[0004]本专利技术的技术方案为：一种引物组，包括QX型特异性引物、4/91型特异性引物、H120型特异性引物以及LDT3型特异性引物；
[0005]其中QX型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，QX型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0006]4/91型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，4/91型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0007]H120型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，H120型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0008]LDT3型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，LDT3型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0009]本专利技术还公开了上述引物组在区分LDT3型IBV疫苗、H120型IBV疫苗、4/91型IBV疫苗和QX型IBV疫苗中的应用。
[0010]本专利技术还公开了一种区分LDT3型IBV疫苗、H120型IBV疫苗、4/91型IBV疫苗和QX型IBV疫苗的多重PCR检测方法，包括如下步骤：
[0011]S1：根据H120型IBV、4/91型IBV、QX型IBV以及LDT3型IBV的核苷酸序列分别设计如权利要求1所述的引物组；
[0012]S2：核酸提取、cDNA的合成及重组质粒的制备；
[0013]S3：建立单重PCR扩增反应体系；
[0014]S4：建立多重PCR扩增反应体系。
[0015]进一步限定，所述多重PCR的退火温度为52.2℃。
[0016]进一步限定，所述多重PCR中4组引物的浓度均为10umol/L。
[0017]进一步限定，所述多重PCR的循环次数为35。
[0018]进一步限定，所述LDT3型IBV、H120型IBV、4/91型IBV以及QX型IBV的检测浓度分别不低于1.13
×
105copies/uL、7.56
×
104copies/uL、4.61
×
104copies/uL以及2.94
×
104copies/uL。
[0019]本专利技术还公开了一种基于上述所述的方法区分LDT3型IBV疫苗、H120型IBV疫苗、4/91型IBV疫苗和QX型IBV疫苗的试剂盒。
[0020]本专利技术还公开了一种上述所述的方法在筛选IBV疫苗毒株中的应用。
[0021]本专利技术还公开了一种上述所述的方法在检测临床疫苗毒株的单一性中的应用。
[0022]本专利技术的有益效果为：多重PCR方法特异性好，检测速度快，灵敏度高，具有良好的应用前景，能够检测出现有市面上的疫苗中存在上述四种病毒中的哪一种或哪几种，将同时含有几种病毒的疫苗进行标记作为临床参考。
附图说明
[0023]图1是重组质粒鉴定电泳图；
[0024]图2是多重PCR退火温度的优化电泳图；
[0025]图3是多重PCR引物浓度优化电泳图；
[0026]图4是多重PCR循环数优化电泳图；
[0027]图5是多重PCR特异性检测电泳图；
[0028]图6是多重PCR灵敏性优化电泳图；
[0029]图7是多重PCR重复性测试电泳图；
[0030]图8是多重PCR临床样品检测电泳图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术的实施例进行详细、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]本
技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本专利技术所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的
意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0033]实施例1
[0034]1.设计基因和疫苗株
[0035]QX型IBV和4/91型IBV的S1基因均通过NCBI序列号合成，LDT3型IBV、H120型IBV、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV，La Sota株)、马立克病毒(Marek
’
s disease virus，MDV，CVI988株)、禽白血病病毒(Avian leucosis Virus，ALV，JS09GY3株)、传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV，Connecticut株)、禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV，SCneijiang株)为动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括QX型特异性引物、4/91型特异性引物、H120型特异性引物以及LDT3型特异性引物；其中QX型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，QX型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；4/91型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，4/91型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；H120型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，H120型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；LDT3型特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，LDT3型特异性引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。2.权利要求1所述的引物组在区分LDT3型IBV疫苗、H120型IBV疫苗、4/91型IBV疫苗和QX型IBV疫苗中的应用。3.一种区分LDT3型IBV疫苗、H120型IBV疫苗、4/91型IBV疫苗和QX型IBV疫苗的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：根据H120型IBV、4/91型IBV、QX型IBV以及LDT3型IBV的S1核苷酸序列分别设计如权利要求1所述的引物组；S2：核酸提取、cDNA的合成及重组质粒的制备；S3：建立单重PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鑫，晏文俊，王红宁，李豪，付雪，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：