一种呼吸道病毒检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸道病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测SARS

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道病毒检测试剂盒和方法


[0001]本专利涉及一种临床检验用途的病毒检测试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，用于SARS
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COV
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2病毒的核酸检测。该试剂盒采用双重PCR 的方法，使用人源内标RNase P，有效质控全过程，降低假阴性。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Covs)是感染人类和动物的重要病原体，通常与呼吸道和胃肠道感染有关。Covs是直径为100
‑
160纳米的球囊包膜病毒。每个病毒中包含一个27
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32kb的正链单链rna基因组。病毒包膜包含三种不同的蛋白质:膜蛋白 (m)、包膜蛋白(e)和穗蛋白(s)。M蛋白结合核衣壳，参与病毒的组装和出芽， E蛋白参与病毒的形成和释放。S蛋白形成识别细胞受体的同源三聚体，从而协助病毒进入靶标细胞。此前，covs一直被认为是人类的次要病原体，通常认为只和普通感冒或轻微呼吸道感染有关，极少数例外会引起婴儿、幼儿和老年人的严重感染，直到2002年SARS爆发完全扭转了以前人们对冠状病毒的认识。这种由冠状病毒引起的严重急性呼吸道综合征可导致高达10％的死亡率。而2019年末爆发的COVID
‑
19，虽然总体的致死率低于SARS，但是由于其起病更加隐匿，主诉症状更加不典型，潜伏期更是长达14天等特征，使得其防控难度非常大，SARSCoV
‑
2的全球传播系数接近3，高于SARS和MERS。
[0003]SARS CoV
‑r/>2核酸检测在冷链食品的防疫检测和高风险人群的核酸筛查方面都具有重要意义。核酸试剂盒的市场需求巨大。本专利采用双重PCR的方法，以目前多数采用的病毒ORF1ab区和N区作为目标片段采用不同荧光基团标记的 Taqman探针，在同一管内实现SARS CoV
‑
2的目标片段和人源内标基因的同时检测，可以有效质控整个检测过程，避免由于核酸质量问题所造成的假阴性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种更为准确的呼吸道病毒检测试剂盒，特异性好，灵敏度高。
[0005]一种呼吸道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测 SARS
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COV
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2病毒的ORF1ab区域和N区，包括以下引物和探针：扩增ORF1ab 区域扩增引物ORF1ab
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F、ORF1ab
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R，探针ORF1ab
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probe；扩增N区域扩增引物N
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F、N
‑
R，探针N
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probe，其序列如下：
[0006]ORF1ab
‑
F：TCTGCGGTATGTGGAAAGG
[0007]ORF1ab
‑
R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCC
[0008]ORF1ab
‑
probe：FAM
‑
TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT
‑
BHQ1
[0009]N
‑
F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAAC
[0010]N
‑
R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATT
[0011]N
‑
probe：FAM
‑
CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT
‑
BHQ1.
[0012]进一步的，所述检测试剂盒还包括用于检测人源内标基因RNase P基因的以下引
物和探针：扩增内标基因RNase P基因的扩增引物Rnase
‑
P
‑
F、Rnase
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P
‑
R，探针Rnase
‑
P
‑
probe，其序列如下：
[0013]Rnase
‑
P
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F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGG
[0014]Rnase
‑
P
‑
R：TCCCACTACAGCCCACTCC
[0015]Rnase
‑
P
‑
Probe：VIC
‑
CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC
–
BHQ1.
[0016]进一步的，本专利技术的试剂盒分别提供了阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有相应目的片段的合成质粒溶液；所述阴性对照为无相应目的片段溶液。
[0017]本专利技术还提供了一种呼吸道病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0018](1)提取血清的病毒RNA；
[0019](2)将RNA反转录为cDNA；
[0020](3)扩增：检测体系qPCR扩增反应液包括：ReverTra Ace qPCR RT Kit(T OYOBO公司)；THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2
×
)、ORF1ab上、下游引物各0.8uM、ORF1ab探针0.4uM；N上、下游引物各0.8uM、N
‑
probe(探针) 0.4uM；Rnase
‑
P上、下游引物各0.8uM、Rnase
‑
P
‑
probe(探针)0.4uM；其序列为：
[0021]ORF1ab
‑
F：TCTGCGGTATGTGGAAAGG
[0022]ORF1ab
‑
R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCC
[0023]ORF1ab
‑
probe：FAM
‑
TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT
‑
BHQ1
[0024]N
‑
F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAAC
[0025]N
‑
R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATT
[0026]N
‑
probe：FAM
‑
CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT
‑
BHQ1
[0027]Rnase
‑
P
‑
F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGG
[0028]Rnase
‑
P
‑
R：TCCCACTACAGCCCACTCC
[0029]Rnase
‑
P
‑
Probe：VIC
‑
CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC
–
BHQ1；
[0030]反应条件：95℃预变性1min；95℃15s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测SARS
‑
COV
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2病毒的ORF1ab区域和N区，包括以下引物和探针：扩增ORF1ab区域扩增引物ORF1ab
‑
F、ORF1ab
‑
R，探针ORF1ab
‑
probe；扩增N区域扩增引物N
‑
F、N
‑
R，探针N
‑
probe，其序列如下：ORF1ab
‑
F：TCTGCGGTATGTGGAAAGGORF1ab
‑
R:TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCCORF1ab
‑
probe：FAM
‑
TTGTGATCAACTCCGCGAACCCAT
‑
BHQ1N
‑
F：GGCAGTAACCAGAATGGAGAACN
‑
R:ATTTGGTCATCTGGACTGCTATTN
‑
probe：FAM
‑
CAAAACAACGTCGGCCCCAAGGT
‑
BHQ1。2.根据权利要求1所述的呼吸道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于检测人源内标基因RNase P基因的以下引物和探针：扩增内标基因RNase P基因的扩增引物Rnase
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P
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F、Rnase
‑
P
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R，探针Rnase
‑
P
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probe，其序列如下：Rnase
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P
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F：ATTGGGTGTTCAAGAGGAGGRnase
‑
P
‑
R：TCCCACTACAGCCCACTCCRnase
‑
P
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Probe：VIC
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CAACAGGAAGACACCTTGGGGGAAC
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BHQ1。3.根据权利要求2所述的呼吸道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。4.一种呼吸道病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：林筱剑，
申请(专利权)人：武汉艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：