一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3‑like杀虫基因及应用。所述芽孢杆菌SJ110属于东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensis，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号CCTCC NO：M2020524。生物活性测定表明菌株SJ110、杀虫蛋白、vip3‑like杀虫基因对甜菜夜蛾、棉铃虫以及秀丽隐杆线虫具有很高的毒性。表明菌株SJ110及其杀虫蛋白、vip3‑like杀虫基因可用于农业害虫的防治。

【技术实现步骤摘要】
一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因及应用
本专利技术涉及生物防治
，具体涉及一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因及应用。
技术介绍
芽孢杆菌(如苏云金芽孢杆菌)在生长过程中能够生产对多种昆虫、线虫、原生动物和癌细胞等具有生物活性的多种杀虫因子。如杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins,ICPs)、几丁质酶、苏云金素以及营养期杀虫蛋白(VegetativeInsecticidalProteins,VIPs)等。不同于传统的化学农药，这些杀虫因子具有对人畜无毒害作用、环境友好以及杀虫谱广且易发酵特点，这将非常的有利于农林病虫防治以及转基因作物的应用。杀虫晶体蛋白(ICPs)是Bt在生长过程中产生的δ-内毒素，是Bt主要的杀虫因子成分之一，以伴胞晶体的形式在菌体内累积。ICPs主要分为晶体蛋白(Crystalprotein,Cry)和胞外溶解性蛋白(Crtolyticprotein,Cyt)两类蛋白，其中Cry毒素蛋白是最早应用于农作物害虫的防治Bt毒素蛋白。营养期杀虫蛋白(VegetativeInsecticidalProteinsVIPs)是在Bt菌株生长对数期所产生形成，其与ICPs蛋白氨基酸序列没有同源性，是一种新型的杀虫蛋白。最早是在1996年Estruch等人发现了Vip3Aa和Vip3Ab蛋白，该蛋白于细菌的营养期生长阶段开始分泌。在四个Vip蛋白家族中被发现的超过100个中以Vip3的研究最为深入广泛，且只有Vip3被运用于转基因作物中。目前，少有研究报道新型东洋芽孢杆菌Bacillustoyonensis及其杀虫蛋白、基因在杀虫方面的应用。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因及应用。本专利技术技术方案如下：本专利技术获得新型芽孢杆菌SJ110及其杀虫蛋白和vip3-like杀虫基因，所述芽孢杆菌SJ110属于东洋芽孢杆菌Bacillustoyonensis，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号CCTCCNO：M2020524，保藏日期2020.09.21，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述vip3-like杀虫基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。另一方面，本专利技术还提供了所述芽孢杆菌SJ110、所述杀虫蛋白和所述vip3-like杀虫基因在杀虫方面的应用。进一步的，所述虫为鳞翅目昆虫和/或小杆线虫目昆虫。进一步的，所述虫为鳞翅目夜蛾科昆虫和/或小杆线虫目小杆科昆虫。更进一步的，所述虫为棉铃虫、甜菜夜蛾和/或秀丽隐杆线虫。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种新芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白及其vip3-like杀虫基因，生物活性测定表明菌株SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因对甜菜夜蛾、棉铃虫以及秀丽隐杆线虫具有很高的毒性。表明菌株SJ110及其杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因可用于农业害虫的防治。附图说明图1：A为考马斯亮蓝染色光学显微镜观察；B为扫描电镜观察；图2：菌株SJ110蛋白SDS-PAGE分析；注：PM为蛋白分子量标准，Lane1与Lane2为菌株SJ110蛋白，Lane3为苏云金芽胞杆菌YBT1520蛋白；图3：vip3-like基因PCR克隆出2832bp目的片段；注：Lane1、Lane2、Lane3以及Lane4为vip3-like基因片段，M为核酸分子标准量。图4：Vip3-like表达蛋白纯化结果。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。实施例1菌株SJ110的筛选与鉴定在海南岛热带雨林中选取生态环境人为干预少、土壤腐殖质丰富的地方采集土壤样品。采用Bt菌株的醋酸钠-温度筛选法，称取5g左右土壤放入20mLBPA(牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％)培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4-5h，75℃水浴15min，取1mL上清稀释至10-3、10-4和10-5，各吸取200μL均匀涂布于NB(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠3.4％)培养平板，30℃倒置培养3d，挑取形态各异的单菌落划平板。芽孢杆菌培养3-5d形成芽孢后，进一步利用考马斯亮蓝染色和光学显微镜观察，观察到无色芽孢和蓝色伴胞晶体。16SrDNA序列同源性分析，认定其为Bacillustoyonensis菌株，菌株编号为SJ110。(图1)实施例2扫描电镜观察晶体蛋白菌株SJ110在G-Tris培养基中30℃培养至芽孢完全形成，4℃，12,000g离心10min收集500μL菌体，然后用1M冰冷的NaCl洗涤菌体3次，最后菌体悬浮于500μL冰冷超纯水中。取10μL芽孢和伴胞晶体混合物小心平铺在洁净的盖玻片上，4℃低温真空干燥，然后用1％四氧化锇(OsO4)进行样品固定，样品被置于金属样品台上，放入真空蒸发器中喷镀一层约20nm厚的金属膜。准备好的样品置于S3-400N扫描电镜(HITACHILtd，Japan)，20kV电压条件下进行图像观察记录。实施例3SDS-PAGE电泳分析菌株晶体蛋白一般7.5％或者12％的SDS-PAGE可用于分析晶体蛋白组成，5μL制备好的伴胞晶体蛋白与5μL的2×SDS-PAGEsampleBuffer[0.075MTris·Cl,(pH6.8)；0.02MEDTA；2％SDS；0.02％bromophenolblue；0.25Mdithiothreitol(DTT)；50％glycerol]混合，100℃沸水中煮5min，然后12,000g离心5min，上清立即上样，在100V电压下，利用Mini-ProteinII,cellslabverticalapparatus装置(BioRad，USA)电泳大约1h，然后用CoomassieblueR250进行染色，蛋白质大小根据标准蛋白质量标准进行判断。实施例4菌株SJ110基因组DNA提取单菌落接种于7mL的LB液体培养基中，30℃，220rpm培养过夜，1％转接于盛有50mL的LB培养基的250mL体积的三角瓶中，30℃，220rpm继续培养4小时至OD600＝1.0～2.0；离心收集10mL菌体，2mLJBuffer(0.1MTrisHCl(pH8.0)、0.1MEDTA(pH8.0)、0.15MNacl)洗涤沉淀；将沉淀轻悬于2mLJBuffer中加入80μL新鲜配制的溶菌酶(50mg/mL)，混匀，37℃温育45min；再加入15μLRNase(10mg/mL)，50℃作用15min；接着加入200μLSDS(20％)，70℃处理20min；缓慢冷却至37℃，用等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)及氯仿：异戊醇(24∶1)各抽提一次，再加入等体积异戊醇混匀置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芽孢杆菌SJ110，其特征在于，所述芽孢杆菌SJ110属于东洋芽孢杆菌Bacillustoyonensis，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号CCTCC NO：M2020524。/n

【技术特征摘要】
1.芽孢杆菌SJ110，其特征在于，所述芽孢杆菌SJ110属于东洋芽孢杆菌Bacillustoyonensis，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号CCTCCNO：M2020524。


2.一种杀虫蛋白，其特征在于，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种vip3-like杀虫基因，其特征在于，所述vip3-like杀虫基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：张文飞，王俊慧，何佳利，金映虹，赵子君，孙杰，王锐萍，
申请(专利权)人：海南师范大学，海口海森元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46