本发明专利技术提供了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株D1及其微生物菌剂在防治马铃薯晚疫病方面的应用。该菌株是从药用植物马比木中分离筛选得到的具有拮抗作用的菌株，其微生物菌剂是利用该菌株的发酵液获得。本发明专利技术最显著的特征是：提供了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株D1，其发酵液制备的微生物菌剂对马铃薯晚疫病具有良好的防治作用，是植物种植产业上重要的微生物资源。
【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治马铃薯晚疫病中的应用
本专利技术涉及微生物
，特别是指一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其制备的微生物菌剂在防治马铃薯晚疫病中的应用。
技术介绍
马铃薯(SolanumtuberosumL.)是仅次于水稻，小麦和玉米的第四大粮食作物，原产于南美洲，目前在世界150多个国家和地区栽培。现在，全球马铃薯种植的总面积约为1838万hm2，每年的总产量接近3亿吨。中国是世界马铃薯生产大国，其生产产量和种植面积均为世界第一位。据统计，我国2008年种植马铃薯的面积已经超过580万hm2，产量为8480万顿，面积和产量分别占全世界的1/4和1/5。随着马铃薯种植面积的不断扩大，以及连作重茬，严重危害马铃薯的病害种类日益增多，使马铃薯产业损失惨重。在这些病害中，由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病对马铃薯生产的影响最大，常导致马铃薯品质和产量大幅度下降甚至绝收，其防止难度和危害程度已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被列为全球第一大真菌病害。马铃薯晚疫病于1845年首次在爱尔兰大流行，引发了震惊世界的“爱尔兰大饥馑”事件，使爱尔兰当时800万的人口锐减到500万，其中100万人被饿死，200万人逃亡海外。该病每年给全球造成的损失约170亿美元，给中国带来的损失约80亿人民币，已成为遏制马铃薯生产和实现产业化的一大障碍。常规的杂交育种方法仍然是我国目前马铃薯育种的主要方法，但已由单纯的品种间杂交育种方法转向为种间杂交，主要将近缘栽培种和野生种的抗病基因转移到栽培种中。但是由于野生种与栽培种存在着广泛的有性生殖障碍，杂交非常困难，甚至不能杂交成功；而且需要较长的年限，受季节和气候的制约，其利用具有一定的局限性。虽然生物技术的发展为杂交育种提供了便利，但目前生产上可应用的抗晚疫病的马铃薯种薯资源缺乏、加之品种抗病性的丧失，这一技术在实际应用上存在许多问题。于是研究者把目光投向了化学药剂，化学药剂见效快，只要使用得当，可以收到很好的防治效果。主要包括苯基酰胺类的甲霜灵、恶唑烷酮，氨基甲酸酯类的霜霉威，烷基磷酸盐类的乙磷铝和吗啉类的烯酰吗啉、氟吗啉等，但是该类药剂生产成本较高，售价昂贵，作用位点单一，利于晚疫病菌抗药性株系的迅速产生，往往只对已经侵入到植株体内的病原菌有杀灭作用，因此在使用上具有一定的限制。并且随着化学农药长期的大量使用，不仅造成了严重的环境污染和农药残留问题，还导致病原菌产生抗药性及交互抗性等问题。这使得寻求稳定、有效、安全的生物防治方法势在必行。目前解淀粉芽孢杆菌的研究不断增多，其代谢产物丰富，产生多种表面活性物质，如专利CN101935633A(申请日2010.07.06)公开了一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌在油泥洗脱中的应用，实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害；另外如专利CN104630086A(申请日2014.11.20)中公开了解淀粉芽孢杆菌RL263对稻瘟病有高效的防治作用，专利CN103937727A(申请日2014.05.06)公开了一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌Z5，这些专利均表现其主要研究是应用于抑制真菌和细菌活性等方面。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株在之前的专利CN201610194873.X中、及文献《解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用》中已经披露了其获取方法及培养方法等，以及用于烟草白粉病贺花粉病的防治，但尚未发现对马铃薯晚疫病病菌有抑制、防治的解淀粉芽孢杆菌，因此，本研究团队在对D1的进一步研究中，很高兴的发现，D1及其制成的微生物菌剂，能对马铃薯晚疫病达到有效的防治作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是减少化学农药来防治马铃薯晚疫病造成的环境污染、人畜病害，提供解淀粉芽孢杆菌菌株D1及其微生物菌剂的新应用，即用于对马铃薯晚疫病的防治。本专利技术的技术方案是：解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯晚疫病中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年9月21日，保藏编号为CCTCCNO:M2015528。所述解淀粉芽孢杆菌菌D1是采用下述分离培养方法获得：(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1-5‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2～4min，无菌水冲洗2～3次；0.1-0.5％升汞表面消毒1～3min，后用无菌水冲洗3～4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4～6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于22-30℃恒温培养1～3天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，22-30℃下培养2～4d，观察没有污染后，贴好标签放于0～5℃的冰箱中保存，即得D1菌株。更具体地，所述解淀粉芽孢杆菌菌株D1的分离培养方法是：(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2～4min，无菌水冲洗2～3次；0.1％升汞表面消毒1～3min，后用无菌水冲洗3～4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4～6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于28℃恒温培养1～3天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，28℃下培养2～4d，观察没有污染后，贴好标签放于4℃的冰箱中保存，即得D1菌株。本专利技术还提供了由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株和PD培养基培养获得的微生物菌剂在防治马铃薯晚疫病中的应用。所述微生物菌剂制备方法，包括以下步骤：步骤1：将活化的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，20-32℃、100-200r/min摇床培养18-30h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，26-36℃、100～150r/min发酵培养24-60h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，26-36℃、100-200r/min发酵培养24-60h，即得微生物菌剂。进一步地，本专利技术的菌剂经下列步骤得到：步骤1：将活化的解淀粉本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯晚疫病中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D1菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年9月21日，保藏编号为CCTCC NO:M2015528。/n
【技术特征摘要】
1.解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯晚疫病中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年9月21日，保藏编号为CCTCCNO:M2015528。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株的应用，其特征在于，所述菌株是从药用植物马比木(Nothapodytespittosporoides)中分离获得，其分离培养方法步骤如下：
(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；
(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1-5‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2～4min，无菌水冲洗2～3次；0.1-0.5％升汞表面消毒1～3min，后用无菌水冲洗3～4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4～6mm大小的组织切段；
(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于22-30℃恒温培养1～3天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的单菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，22-30℃下培养2～4d，观察没有污染后，贴好标签放于0～5℃的冰箱中保存，即得D1菌株。
3.根据2所述的D1菌株的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；
(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，...
【专利技术属性】
技术研发人员：康冀川，汪健康，韩龙，雷帮星，何张江，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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