一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基及其发酵方法技术

本发明专利技术涉及酵母菌发酵技术领域，公开了一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基。本发明专利技术还提供了该巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵方法。本发明专利技术可调节毕赤酵母细胞代谢生长、促进外源蛋白表达、抑制蛋白酶活性，更有利于重组蛋白及多肽的稳定表达，且可以调控发酵过程，达到在不使用液氧的条件下，不仅使得巴斯德毕赤酵母菌达到高密度发酵的水平，而且有效缩短整个发酵的周期。

【技术实现步骤摘要】
一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基及其发酵方法
本专利技术涉及酵母菌发酵
，具体而言，涉及一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基及其发酵方法。
技术介绍
毕赤酵母菌作为一种单细胞真核生物，既具有原核生物结构简单遗传背景清楚的特点，又具有真核生物严格的基因调控机制和对表达产物的翻译后修饰的能力，自身不含有内毒素、热源、病原体，是一种非常安全的表达宿主，已经成为最有效的表达外源蛋白的表达系统之一。据文献资料统计已有数千种外源蛋白已经实现了在毕赤酵母体系中成功表达，其中有很多已经实现了大规模工业化生产。而目前毕赤酵母的发酵培养基多是以invitrogen公司提供的BSM培养基为主，其主要成分：85％磷酸26.7ml/L、无水硫酸钙0.93g/L、硫酸钾18.2g/L、七水硫酸镁14.9g/L、氢氧化钾4.13g/L、甘油40g/L、PTM14.35ml/L，中国专利201110327865.5、中国专利201610585373.9等均采用的上述BSM培养基。而使用BSM培养基在发酵毕赤酵母的过程中存在一些缺陷，主要有以下几点：(1)BSM培养基磷酸含量高，培养基初始pH低于1.0，偏离了正常的pH电极2～12正常工作范围，对pH电极损伤较大，严重缩短了pH电极的使用寿命；(2)使用BSM培养基在发酵过程中需要添加25～30％的氨水，一方面充当氮源，另一方面起到调节培养基pH的作用，发酵过程中一般需要维持恒定的pH条件，一般范围是pH3～7，而氨水易挥发具有强烈的刺激性气味，一方面给生产过程中工人的配料补料操作带来了极大的不便，另一方面由于氨水的易挥发特性，导致补料的过程中对氨水的利用率偏低，且有一部分的氨水挥发跟随尾气一起排放到室外给环境带来了较大的污染；(3)毕赤酵母发酵补料培养过程一般分为两个阶段，一个阶段是甘油补料阶段，另一个阶段是甲醇诱导补料阶段，在甘油补料阶段一般向发酵罐中添加50％浓度灭菌甘油作为碳源，诱导阶段以100％的甲醇作为碳源，甘油粘稠称量配料过程操作较为麻烦，大规模工业化生产成本较高，诱导阶段单纯补充甲醇，使毕赤酵母细胞生长缓慢，整个发酵周期长，毕赤酵母细胞难以快速达到高密度发酵水平；(4)使用BSM培养基在毕赤酵母高密度发酵的中后期，毕赤酵母容易出现菌体老化、自溶、蛋白酶分泌量增加等情况，从而导致重组蛋白出现降解，蛋白表达量大幅度衰减的现象；(5)毕赤酵母发酵中后期一般需要通入液氧，来维持发酵过程中溶氧曲线在20～50％范围内波动，这一方面提高了生产的成本，另一方面由于诱导阶段补料是甲醇，属于易燃易爆物品，液氧的使用也给生产带来了安全隐患。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，可以调节毕赤酵母细胞代谢生长、促进外源蛋白表达、抑制蛋白酶活性，更有利于重组蛋白及多肽的稳定表达。本专利技术的第二个目的在于提供一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵方法，用于调控发酵过程，达到了在不使用液氧的条件下，不仅使得巴斯德毕赤酵母菌达到了高密度发酵的水平，而且有效缩短了整个发酵的周期。本专利技术的实施例是这样实现的：一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基；所述基础培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～25g/L，K2HPO4·3H2O1.5～20g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，生物素0.02～0.2g/L，葡萄糖50～260g/L，CaCO30.1～1.6g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L和微量元素0.002～0.012g/L；所述第一分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，葡萄糖200～1040g/L，CaCO30.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L和微量元素0.006～0.028g/L；本专利技术采用更容易被酵母吸收且成本低廉的葡萄糖作为培养基的基础碳源，相比较甘油更加有优势；采用无机铵盐充当氮源，避免了大规模工业化生产中挥发性氨水的使用，给发酵车间工人的配料补料过程提供了极大的便利，同时还能有效避免氨水的挥发带来的尾气异味及环境污染的问题。本专利技术的第一分批补料培养基使用上述各物质组合，相较于现有的单纯添加甘油和微量元素，可以有效延长酵母细胞的生长活力，减少代谢副产物对酵母细胞的生长抑制。所述第二分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，CaCO30.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，甲醇500～880g/L，多元醇6～60g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L和微量元素0.006～0.028g/L。本专利技术的第二分批补料培养基中混合使用甲醇和多元醇，甲醇和多元醇混合流加，甲醛异化代谢途径被减弱，毒副中间产物的积累显著缓解，甲醇的利用效率得到明显改善，可以提高蛋白的表达水平和发酵稳定性；混合流加甲醇和多元醇可以有效改变酵母细胞的代谢途径，提高毕赤酵母菌的呼吸活性和能量运转效率，加快菌体生长速度；给细胞提供了基本的能量的同时增强了重组蛋白的合成代谢途径，甲醇消耗量减少，副产物代谢途径被削弱，具体表现为混合流加时发酵周期明显缩短，发酵上清液为淡黄绿色，发酵液刺激性异味小；而单纯流加甲醇的发酵周期较长，上清液为深绿色且有明显刺激性异味。本专利技术采用的基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基的pH条件温和，处于工业化pH电极2～12的正常范围内，避免了培养基条件过酸性对pH电极的损伤，大大延长了pH电极的使用寿命。进一步地，所述多元醇为丙三醇、山梨醇、甘露醇或木糖醇中的一种或几种。进一步地，所述无机铵盐为氯化铵、硫酸铵、硫酸氢铵、碳酸铵或硝酸铵盐中的一种或几种。进一步地，所述氨基酸混合物为亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸中的至少两种。本专利技术采用上述氨基酸及其混合物具有促进酵母细胞增殖，减少酵母细胞表达外源蛋白过程中副产物的产生的作用。进一步地，所述微量元素包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O4～8g/L，NaI0.3～0.5g/L，MnSO4·H2O4～6g/L，Na2MoO4·2H2O0.1～0.3g/L，H3BO40.1～0.2g/L，CoCl20.5～1.5g/L，ZnCl225～35g/L，FeSO4·7H2O75～95g/L和H2SO40.003～0.006g/L。现有的毕赤酵母发酵所用微量元素基本通过0.22um滤膜过滤的方式进行进行除菌，配料过程及其繁琐，不利于大规模工业化生产，本专利技术采用invitrogen微量元素PTM1去除生物素，可以连同基础培养基一起进行湿热灭菌，且不影响发酵的效果，大大简化了生产过程，节约生产成本。一种巴斯德毕赤酵母菌高密本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基；/n所述基础培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～25g/L，K

【技术特征摘要】
1.一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基；
所述基础培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～25g/L，K2HPO4·3H2O1.5～20g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，生物素0.02～0.2g/L，葡萄糖50～260g/L，CaCO30.1～1.6g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.002～0.012g/L；
所述第一分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，葡萄糖200～1040g/L，CaCO30.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.006～0.028g/L；
所述第二分批补料培养基包括以下浓度的组分：无机铵盐1～35g/L，MgSO4·7H2O3～16g/L，KCl2～12g/L，CaCO30.1～1.6g/L，生物素0.02～0.2g/L，甲醇500～880g/L，多元醇6～60g/L，氨基酸混合物0.1～4g/L，微量元素0.006～0.028g/L。


2.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述多元醇为丙三醇、山梨醇、甘露醇或木糖醇中的一种或几种。


3.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述无机铵盐为氯化铵、硫酸铵、硫酸氢铵、碳酸铵或硝酸铵盐中的一种或几种。


4.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述氨基酸混合物为亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸中的至少两种。


5.一种巴斯德毕赤酵母菌高密度发酵方法，包括以下步骤：
S1：预先对巴斯德毕赤酵母菌培养一级种子；
S2：预先用氢氧化钠或氢氧化钾调节基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基的pH为6，并对基础培养基、第一分批补料培养基和第二分批补料培养基进行灭菌；
S3：将步骤S1中巴斯德毕赤酵母菌一级种子液接种于权利要求1～4任一项所述的基础培养基培养二级种子和三级种子；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊，周浩，郝东，何华斌，魏文培，侯增淼，
申请(专利权)人：西安德诺海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61