一种生产富含多巴重组贻贝粘蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产富含多巴重组贻贝粘蛋白的方法。以毕赤酵母为宿主菌进行重组贻贝粘蛋白与酪氨酸酶共表达发酵，对经毕赤酵母体内多巴修饰的重组贻贝粘蛋白进行纯化，在体外由其他不同来源的酪氨酸酶在含有抗坏血酸乙基醚、谷氨酸、富马酸和硫酸铜的混合体系中进一步多巴修饰，得多巴氧化率与天然贻贝粘蛋白接近的重组贻贝粘蛋白。本发明专利技术获得的富含多巴重组贻贝粘蛋白与天然贻贝粘蛋白相比具有分子量分布均匀的优势，而且纯度高，可以用作高粘附力的粘附材料，在海洋工程、生物医学及表面化学等领域具有广阔的应用前景。表面化学等领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生产富含多巴重组贻贝粘蛋白的方法


[0001]本专利技术属于基因工程及发酵工程领域，涉及一种类贻贝粘蛋白的制备方法，具体涉及经宿主菌体内及体外修饰提升重组贻贝粘蛋白多巴氧化率。

技术介绍

[0002]贻贝粘蛋白(Mussel adhesive protein，MAP)在贻贝足的腺体内生成和储存，又称为贻贝足丝蛋白，具有高强度、高韧性、防水性和超强的粘附性。研究表明，贻贝粘蛋白能粘附于几乎所有的固体材料表面，其具备高粘附性的关键在于结构中所富含的3,4
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二羟基苯丙氨酸(DOPA，多巴)功能元。DOPA是一种侧基为儿茶酚(邻苯二酚)官能团的氨基酸，DOPA的苯酚基团具有很强的金属螯合能力，能在材料表面形成不可逆的有机金属络合物，还能与蛋白质等极性聚合物形成很强的氢键。因此，DOPA对贻贝粘蛋白的防水性黏合及内聚力起关键作用。
[0003]目前贻贝粘蛋白产品主要是通过从贻贝足丝中直接提取制得，这些蛋白产品的DOPA含量从0.2mol％到30mol％不等，分子量的分布也从5～7KDa至108KDa，具有不均一性，导致天然贻贝粘蛋白在实际应用中受限。
[0004]借助基因工程技术获得的重组贻贝粘蛋白一定程度上解决了提取的贻贝粘蛋白分子量分布均一性差的问题，但其粘附性相对较弱，为此中国专利CN105936916A采用植物表达系统，旨在借助真核表达对翻译后的重组蛋白更高的糖基化和磷酸化水平，达到增加粘附性和实现规模化生产的目的。但该专利中的植物表达系统构建流程复杂，也未能对植物体内表达的重组蛋白的粘附性进行实验验证。尽管有报道在贻贝粘蛋白的原核表达中于宿主体内进行酪氨酸残基的多巴修饰，但原核宿主的共表达诱导发酵时间短，大部分在5～8h内，导致多巴修饰过程存在氧化不充分的问题，影响了重组蛋白粘附能力的进一步提高。中国专利CN115819627A、CN115894655A中以毕赤酵母为例经实验验证了利用分泌表达的重组酪氨酸酶对共表达的重组贻贝粘蛋白在较长时间的发酵过程中实现多巴修饰的可行性(诱导共表达可达40h以上)。
[0005]酪氨酸酶是一种含铜的多功能氧化还原酶，其活性位点具有一个双核的Cu
2+
中心，每个Cu
2+
周围由三个组氨酸形成螯合结构域，在与特异性底物接触时，会通过形成侧氧桥结构提供氧原子，从而实现对底物的氧化。利用酪氨酸酶于体外经氧化修饰底物时，对于小分子底物酪氨酸，其容易进入酪氨酸酶活性中心并获得氧原子，从而由单羟基的酪氨酸转化为邻羟基的DOPA；但对于含有酪氨酸残基的蛋白质底物，由于蛋白质二级结构的螺旋、折叠以及三级空间构象的存在，使得酪氨酸酶的活性中心与底物蛋白中酪氨酸残基的有限碰撞概率减小。这种空间位阻的存在，导致在尝试使用酪氨酸酶对经宿主表达的重组贻贝粘蛋白进行体外多巴修饰后，相应蛋白酪氨酸残基氧化修饰率(即多巴氧化率)并未能显著提高。因此，开发出用于生产富含多巴且粘附力强的重组贻贝粘蛋白的方法具有重要意义。
[0006]有研究提出在原核细胞体内体外采用不同来源的酪氨酸酶对重组贻贝粘蛋白的酪氨酸残基进行体内外协同氧化修饰(袁升.贻贝足丝蛋白Mgfp
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5及其融合蛋白在大肠杆
菌中的表达和粘附性能研究.华中科技大学,2021.DOI:10.27157/d.cnki.ghzku.2021.004489)，但是受限于原核细胞共表达时间短(仅6～8h)以及对修饰体系(主要指酪氨酸酶)优化的评价实际参照酪氨酸单体而不是蛋白中的酪氨酸残基，实际存在多巴修饰不充分的问题，最终重组贻贝粘蛋白的多巴氧化率在10mol％左右，且氧化后的酪氨酸多以多巴醌形式存在，影响修饰后蛋白的分子量分布均匀性和纯度，不利于重组贻贝粘蛋白的后续应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种富含多巴重组贻贝粘蛋白生产方法。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0009]一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0010]以毕赤酵母为宿主菌进行重组贻贝粘蛋白与重组酪氨酸酶共表达发酵，在发酵过程中将该毕赤酵母体内与重组酪氨酸酶共表达的重组贻贝粘蛋白进行初步的多巴修饰，发酵结束后将从发酵液中提取的重组贻贝粘蛋白修饰中间体(即在发酵过程中完成体内初步多巴修饰后的重组贻贝粘蛋白)在含有抗坏血酸乙基醚的体外修饰混合体系中利用添加至该体外修饰混合体系的酪氨酸酶进行二次多巴修饰，然后从该体外修饰混合体系中提取重组贻贝粘蛋白修饰成品，即制得富含多巴重组贻贝粘蛋白。
[0011]优选的，所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列来源于Bacillus megaterium、Bacillus filamentosus、Fictibacillus macauensis或Aliterella atlantica；所述体外修饰混合体系中添加的酪氨酸酶为天然菌菇酪氨酸酶或采用与所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列来源不同或相同的基因序列表达的重组酪氨酸酶。
[0012]优选的，所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列为来源于Bacillus filamentosus的酪氨酸酶基因序列，所述体外修饰混合体系中添加的酪氨酸酶为采用来源于Bacillus megaterium的酪氨酸酶基因序列并经异源表达(例如可为大肠杆菌胞内表达，也可为毕赤酵母胞外表达)所得重组酪氨酸酶。这两种来源的重组酪氨酸酶在内外外修饰中组合使用，最终达到最高的重组贻贝粘蛋白多巴氧化率。
[0013]优选的，所述重组贻贝粘蛋白采用分泌表达，包括采用天然贻贝粘性蛋白(例如目前已经研究并鉴定的粘性蛋白Mfp
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1、Mfp
‑
2、Mfp
‑
3F、Mfp
‑
3S、Mfp
‑
4、Mfp
‑
5、Mfp
‑
6、Mfp
‑
7)基因序列、天然贻贝粘性蛋白功能性片段的编码序列或天然贻贝粘性蛋白功能性片段的组合的编码序列，并经所述毕赤酵母表达的重组粘性蛋白，或者所述重组贻贝粘蛋白包括所述重组粘性蛋白与采用其他基因序列表达的重组蛋白的融合蛋白，即也可为经融合其他基因(例如构成贻贝足丝纤维骨架的蛋白的全长或部分编码序列、人不同型别胶原蛋白的全长或部分编码序列、多聚组氨酸编码序列、层粘连蛋白编码序列、纤连蛋白编码序列、玻连蛋白编码序列等)而表达的重组融合粘性蛋白；与所述重组贻贝粘蛋白共表达的重组酪氨酸酶采用非分泌表达(即该重组酪氨酸酶表达后不分泌到所述毕赤酵母外)。
[0014]优选的，所述毕赤酵母的发酵过程具体包括以下步骤：在经过扩大培养后的毕赤酵母培养体系中进行诱导补料，并诱导培养至发酵结束；所述重组贻贝粘蛋白修饰中间体的提取具体包括以下步骤：发酵结束后将发酵产物固液分离(4～10℃、5000～6500rpm离心
20～30min)，将分离所得发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：以毕赤酵母为宿主菌并进行发酵，在发酵过程中将该毕赤酵母体内与重组酪氨酸酶共表达的重组贻贝粘蛋白进行多巴修饰，发酵结束后将从发酵液中提取的重组贻贝粘蛋白修饰中间体在含有抗坏血酸乙基醚的体外修饰混合体系中利用添加的酪氨酸酶进行二次多巴修饰，然后提取重组贻贝粘蛋白修饰成品。2.根据权利要求1所述一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列来源于Bacillus megaterium、Bacillus filamentosus、Fictibacillus macauensis或Aliterella atlantica；所述体外修饰混合体系中添加的酪氨酸酶为天然菌菇酪氨酸酶或采用与所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列来源不同的基因序列表达的重组酪氨酸酶。3.根据权利要求1所述一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母体内含有的用于表达重组酪氨酸酶的基因序列来源于Bacillus filamentosus，所述体外修饰混合体系中添加的酪氨酸酶为采用来源于Bacillus megaterium的基因序列表达所得重组酪氨酸酶。4.根据权利要求1所述一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：所述重组贻贝粘蛋白包括采用天然贻贝粘性蛋白基因序列、天然贻贝粘性蛋白功能性片段的编码序列或天然贻贝粘性蛋白功能性片段的组合的编码序列，并经所述毕赤酵母表达的重组粘性蛋白，或者所述重组贻贝粘蛋白包括所述重组粘性蛋白与采用其他基因序列表达的重组蛋白的融合蛋白。5.根据权利要求1所述一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：所述毕赤酵母的发酵过程具体包括以下步骤：在经过扩大培养后的毕赤酵母培养体系中进行诱导补料，并诱导培养至发酵结束；所述重组贻贝粘蛋白修饰中间体的提取具体包括以下步骤：发酵结束后将发酵产物固液分离，将分离所得发酵液经层析介质脱盐并浓缩，得重组贻贝粘蛋白修饰中间体提取物。6.根据权利要求5所述一种富含多巴重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于：所述诱导培养的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：周浩，侯增淼，席伟峰，白星晨，
申请(专利权)人：西安德诺海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：