一种重组高产弹性蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种重组高产弹性蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种重组高产弹性蛋白、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因重组
，尤其涉及一种重组高产弹性蛋白
、
制备方法及其应用
。

技术介绍

[0002]弹性纤维是结缔组织细胞外基质中一种很重要的成分，主要由两种组分构成，一种是含量相对丰富的弹性蛋白
(elastin)
，另一种是微纤维
(microfiber)。
对于像肺
、
皮肤
、
肌键
、
血管和弹性软骨等需要重复可逆弹性的组织和器官，弹性蛋白和微纤维共同赋予这些组织和器官以弹性回复和抗张的能力
。
弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白
(tropoelastin)
，在生理条件下，通过赖氨酸氧化酶在赖氨酸残基的选择性氧化，原弹性蛋白经过自凝聚，交联成不可溶的蛋白质，称为弹性蛋白
。
[0003]现已证实，在原弹性蛋白中主要有两个结构域：
(1)
富含非极性氨基酸特别是甘氨酸
(G),
撷氨酸
(V)
，脯氨酸
(P)
和丙氨酸
(A)
的疏水域，常以五到六肽，如
GVGVP,GVGVAP
的重复序列存在；
(2)
富含与交联有关的赖氨酸和丙氨酸的亲水域
。
这些区域通常由被两到三个丙氨酸分隔开的分散的赖氨酸所组成，如
AAAKAAKAA。
[0004]弹性蛋白在肌肤中起到维持与承载皮肤弹性的作用，让肌肤可以任意伸展和卷曲，其功用就如床垫上的弹簧
。
弹性蛋白能够促进角质层细胞迁移和分化，具有减少表皮萎缩，祛除细纹，增强皮肤障碍功能；上调弹性蛋白的表达量，可以促进弹性组织生成，改善皮肤质量，提高皮肤弹性
、
柔软性以及龟裂粗糙皮肤的治愈效果，延缓皮肤衰老；弹性蛋白趋化成纤维细胞，刺激人皮肤成纤维细胞增殖，促进皮肤合成和分泌胶原纤维和基质成分，促进皮肤组织更新和再生，对已衰老皮肤有修复作用，对呈老化状态有赋活作用
。
因此其在医学美容
、
护肤领域具有广阔的应用前景
。
[0005]然而，在天然状态下，弹性蛋白极度不可溶，这限制了其在微生物中的分泌表达
。2011
年，刘莹等人，利用大肠杆菌原核表达体系，其最终表达序列为
〔(VAPGVG)3S〕2
，使得类人弹性蛋白基因的表达水平可提升至大肠杆菌菌体总蛋白的
30
％
‑
40
％之多
。2021
年，英特菲儿公司成功利用酿酒酵母进行弹性蛋白进行表达发酵，但未明确其表达量
。
[0006]弹性蛋白作为一种具备广阔应用前景的医美产品原料，但是目前用于生产弹性蛋白的菌株对弹性蛋白的表达量不高，限制了弹性蛋白的应用
。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是目前用于生产弹性蛋白的菌株对弹性蛋白的表达量不高，限制了弹性蛋白的应用
。
[0008]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种重组高产弹性蛋白，包括弹性蛋白肽段和棕榈酸五胜肽段
。
[0010]进一步地，所述弹性蛋白肽段的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.1
所示
。
[0011]进一步地，所述棕榈酸五胜肽的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.2
所示
。
[0012]进一步地，所述高产弹性蛋白的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.3
所示
。
[0013]具体地，本专利技术选取特定的弹性蛋白序列
VGVAPG
作为重复序列，利用等量递增的方式将其多次重复并在
C
末端添加棕榈酸五胜肽
KTTKS
进行融合表达，作为最终重组高产弹性蛋白的目标蛋白
。
需要说明的是，弹性蛋白序列的非极性氨基酸含量较高，这使得蛋白的亲水性差，本专利技术将其与棕榈酸五胜肽进行融合，棕榈酸五胜肽能够改善其
C
端的亲水性，从而促进整体融合蛋白的分泌表达，提高蛋白的表达量；更进一步地，棕榈酸五胜肽是胶原蛋白
I
碎片末端与棕榈酸缩合后得到的产物，它能够有效促进皮肤中胶原蛋白
、
透明质酸和弹力纤维的增生，本专利技术将棕榈酸五胜肽与弹性蛋白肽段进行融合，得到的重组弹性蛋白能够提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，减少肌肤细纹，增强肌肤紧致感和光泽度
。
[0014]第二方面，本专利技术提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如第一方面所述的重组高产弹性蛋白的核苷酸序列或其互补序列
。
[0015]进一步地，所述的核酸分子，其核苷酸序列如
SEQ.ID.NO.4
或
SEQ.ID.NO.5
所示
。
[0016]第三方面，本专利技术提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核酸分子
。
[0017]第四方面，本专利技术还提供一种能够表达棕榈酸五胜肽与弹性蛋白肽形成融合蛋白的基因工程菌，所述的基因工程菌含有第三方面所述的重组表达载体
。
[0018]进一步地，所述的基因工程菌还能够同时表达二硫键异构酶，所述二硫键异构酶的核苷酸序列如
SEQ.ID.NO.6
所示
。
[0019]进一步地，所述的基因工程菌为毕赤酵母
。
[0020]第五方面，本专利技术还提供如第一方面所述的重组高产弹性蛋白
、
如第二方面所述的核酸分子
、
或如第三方面所述的重组表达载体在组织工程
、
药学或美容护肤领域中的应用
。
[0021]第六方面，本专利技术提供制备如第一方面所述的重组高产弹性蛋白
、
如第二方面所述的核酸分子
、
或如第三方面所述的重组表达载体的方法，包括以下步骤：
[0022]1)pPIC9k
‑
TE66
重组质粒的构建
[0023]本专利技术利用限制性内切酶
NheI
和
XbaI
同尾酶性质，选取弹性蛋白全长氨基酸序列中的
VGVAPG
序列作为重复单元，重复串联若干次后在
C
末端添加棕榈酸五胜肽，获得目的基因序列；在目的基因序列的两端加入酶切位点后，采用定向递归方法进行多次重复连接，获得完整的表达核苷酸，见
SEQ.ID.NO.5
，再经
PCR
扩增后，与毕赤酵母通用表达载体
pPIC9k
进行连接，转化，获得
pPIC9k
‑
TE66本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组高产弹性蛋白，其特征在于，包括弹性蛋白肽段和棕榈酸五胜肽段；所述弹性蛋白肽段的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.1
所示；所述棕榈酸五胜肽的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.2
所示
。2.
如权利要求1所述的重组高产弹性蛋白，其特征在于，所述高产弹性蛋白的氨基酸序列如
SEQ.ID.NO.3
所示
。3.
一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1‑2任一项所述的重组高产弹性蛋白的核苷酸序列或其互补序列
。4.
如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如
SEQ.ID.NO.4
或
SEQ.ID.NO.5
所示
。5.
一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码权利要求3或4所述的核酸分子
。6.
一种能够表达棕榈酸五胜肽与弹性蛋白肽形成融合蛋白的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌含有权利要求5所述的重组表达载体
。7.
如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌还能够同时表达二硫键异构酶，所述二硫键异构酶的核苷酸序列如
SEQ.ID.NO.6
所示
。8.
如权利要求1‑2任一项所述的重组高产弹性蛋白
、
权利要求3‑4任一项所述的核酸分子
、
或权利要求5所述的重组表达载体在组织工程
、
药学或美容护肤领域中的应用
。9.
制备如权利要求1或2所述的重组高产弹性蛋白
、
权利要求3或4所述的核酸分子
、
或权利要求5所述的重组表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)pPIC9k
‑
TE66
重组质粒的构建选取弹性蛋白全长氨基酸序列中的
VGVAPG
序列作为重复单元，重复串联若干次后在
C
末端添加棕榈酸五胜肽，获得目的基因序列；在目的基因序列的两端加入酶切位点后，利用定向递归的方式进行多次重复连接，获得完整的表达核苷酸，经
PCR
扩增后，与毕赤酵母通用表达载体
pPIC9k
进行连接，转化，获得
pPIC9k
‑
TE66
重组质粒；
2)pPICZaA
‑
pPDI
重组质粒的构建以毕赤酵母
GS115
基因组
DNA
为模板，
PCR
制备获得二硫键异构酶核苷酸序列的目标片段
pPDI<...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文培，乔莎，李敏，郝东，赵硕文，侯增淼，
申请(专利权)人：西安德诺海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：