一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及半定量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体，本申请还提供了一种应用检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法。应用本申请的试剂盒及半定量检测方法可以快速、精准的检测出猫体内的SAA含量，具有特异性高、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高等优点，可用于现场检验。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及半定量检测方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及半定量检测方法。
技术介绍
血清淀粉样蛋白A(serumamyloidA，英文缩写SAA)，是由肝细胞产生的分泌到血清中的一种敏感的急性时相反应蛋白，是淀粉样蛋白A(amyloidA，AA)的前体物质，其敏感性及特异性均高于C-反应蛋白(CRP)，在现代医学卫生领域已成为一项新的研究热点，能更好地反应炎症程度，当机体发生感染或损伤时，这种蛋白会在短时间内急剧升高，当机体感染消除后又会迅速降低至正常水平。猫血清淀粉样蛋白A(即猫SAA)作为猫全身炎症反应指标中最灵敏的物质，当SAA值升高时，表明一定会有病变。当猫咪临床症状不清楚时，也可通过检测猫体内是否含有SAA来判断猫是否患有炎症。当患病猫术后或治疗后复检时，也可通过检测猫体内是否含有SAA，可判断手术效果或术后恢复状况及是否有术后感染等情况。临床实验室检测猫SAA一般使用免疫比浊法、化学发光免疫分析、酶联免疫法等方法，其中，免疫比浊法检测成本相对较高，需配套仪器使用；化学发光免疫分析选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物，且化学发光免疫分析的发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发射强度和时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素；酶联免疫法是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测，该方法检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场检验，但其特异性和重复性有待提高。1971年，Faulk和Taylor(Immunochem，8：1081，1971)首先使用免疫胶体金作为标记物用于免疫电镜技术，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法得到了广泛的应用。常用的金标免疫方法有斑点免疫金渗滤法(dotimmune-goldfiltrationassay)和侧向免疫金层析法(bilateralimmune-chromatographicassay)，而侧向免疫金层析法对环境要求严格，长时间检测会受到空气湿度影响，因此该技术在临床上受到约束。胶体金免疫渗滤也是一种成熟的技术，目前在市场上有多家厂商已经生产了多种不同检测物的诊断试剂盒供应，但是尚未有关于检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于如何快速、准确的检测猫SAA，提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及检测方法。为实现上述目的，本申请提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体。作为本申请的进一步改进，所述微孔滤膜上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.3mg/ml～1.5mg/ml，所述封闭液的pH值为6.5～7.0，所述洗涤液的pH值为6.5～7.5。作为本申请的进一步改进，所述封闭液包括0.05％Triton-100和0.2％BSA，所述洗涤液为50mol/L、pH7.2的PBS溶液。作为本申请的进一步改进，所述微孔滤膜上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.8mg/ml。作为本申请的进一步改进，所述胶体金标记的猫SAA抗体按以下步骤制备：S1、胶体金溶液的制备：将100ml、0.01％的氯金酸溶液煮沸，加热搅拌下缓慢加入1％的柠檬三钠1ml～2ml，继续煮沸15min，直至颜色稳定为红色，冷却后用双蒸水恢复到原体积，得到胶体金溶液；用0.1mol/L的K2CO3溶液将所述胶体金溶液的pH值调节至6.5～7.0，再以2000rpm的转速对所述胶体金溶液进行离心，弃去沉淀，得到胶体金溶液；S2、胶体金标记的猫SAA抗体制备：将猫SAA抗体用pH值为7.2的PBS缓冲溶液进行稀释，将稀释好的猫SAA抗体逐滴加入到持续搅拌的步骤S1所述的胶体金溶液中，充分混合均匀，再继续逐滴加入2.5ml、5％的BSA和0.1ml、1％的叠氮化钠，充分混合均匀，4℃条件下静置，静置时间为15h～22h，得到胶体金标记的猫SAA抗体；S3、胶体金标记的猫SAA抗体的纯化：先以2000rpm的转速对所述胶体金标记的猫SAA抗体进行离心，弃去第一沉淀，保留第一上清液，再以10000rpm的转速对所述第一上清液进行离心，弃掉第二上清液，将第二沉淀用pH值为7.2的1mol/LPBS缓冲溶液1ml重悬，得到胶体金标记的猫SAA抗体，4℃保存备用。作为本申请的进一步改进，步骤S2中，所述猫SAA抗体的稀释浓度为0.2mg/ml～0.3mg/ml。作为本申请的进一步改进，包被有猫SAA抗体的所述微孔滤膜按以下步骤制备：将猫SAA抗体应用PBS缓冲溶液稀释后，点样到微孔滤膜上，自然晾干后，将所述微孔滤膜浸入1％BSA溶液中，封闭，室温自然干燥后密封干燥保存。作为本申请的进一步改进，所述点样设备为微量点样器，所述点样量为1ul～2ul。为实现上述目的，本申请还提供了一种应用检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法，包括如下步骤：S1、通过渗滤装置上的通孔向微孔滤膜上滴加封闭液，待所述封闭液完全渗入所述微孔滤膜；S2、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S1中所述的微孔滤膜上滴加待测样本，使所述待测样本充分渗入所述微孔滤膜；S3、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S2中所述的微孔滤膜上滴加洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜；S4、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S3中所述的微孔滤膜上滴加胶体金标记的猫SAA抗体，待所述胶体金标记的猫SAA抗体完全渗入所述微孔滤膜；S5、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S4中所述的微孔滤膜上滴加所述洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜；S6、应用金标读数仪对显色结果进行数值分析；S7、设置一组含猫SAA抗原的标准待测样本，所述标准待测样本中猫SAA抗原的浓度的分别设置为0ug/ml、0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.0ug/ml、8.0ug/ml、10.0ug/ml、14.0ug/ml、18.0ug/ml，将所述标准待测样本分别按S1～S6的步骤进行检测，以所述标准待测样本的检测结果为基准制作标准曲线，所述标准曲线中：以猫SAA抗原浓度为横坐标，所述金标读数仪的数值为纵坐标；将未知猫SAA浓度的未知待测样本按S1～S6的步骤进行检测，根据所述的标准曲线判定结果。作为本申请的进一步改进，步骤S1中，所述封闭液的量为50ul；步骤S2中，所述待测样本的量为25ul；步骤S3中，所述洗涤液的量为50ul；步骤S4中，所述胶体金标记的猫SAA抗体的量为25ul；步骤S5中，所述洗涤液的量为50ul。本申请的有益效果在于，本申请提供了一种检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层(1)、微孔滤膜(2)、吸水垫层(3)以及底板(4)，所述滤液层(1)上设有与微孔滤膜(2)相对应的通孔，所述微孔滤膜(2)上包被有猫SAA抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层(1)、微孔滤膜(2)、吸水垫层(3)以及底板(4)，所述滤液层(1)上设有与微孔滤膜(2)相对应的通孔，所述微孔滤膜(2)上包被有猫SAA抗体。


2.如权利要求1所述的检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述微孔滤膜(2)上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.3mg/ml～1.5mg/ml，所述封闭液的pH值为6.5～7.0，所述洗涤液的pH值为6.5～7.5。


3.如权利要求2所述的检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述封闭液包括0.05％Triton-100和0.2％BSA，所述洗涤液为50mol/L、pH7.2的PBS溶液。


4.如权利要求2所述的检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述微孔滤膜(2)上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.8mg/ml。


5.如权利要求1-4任意一项所述的检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的猫SAA抗体按以下步骤制备：
S1、胶体金溶液的制备：将100ml、0.01％的氯金酸溶液煮沸，加热搅拌下缓慢加入1％的柠檬三钠1ml～2ml，继续煮沸15min，直至颜色稳定为红色，冷却后用双蒸水恢复到原体积，得到胶体金溶液；用0.1mol/L的K2CO3溶液将所述胶体金溶液的pH值调节至6.5～7.0，再以2000rpm的转速对所述胶体金溶液进行离心，弃去沉淀，得到胶体金溶液；
S2、胶体金标记的猫SAA抗体制备：将猫SAA抗体用pH值为7.2的PBS缓冲溶液进行稀释，将稀释好的猫SAA抗体逐滴加入到持续搅拌的步骤S1所述的胶体金溶液中，充分混合均匀，再继续逐滴加入2.5ml、5％的BSA和0.1ml、1％的叠氮化钠，充分混合均匀，4℃条件下静置，静置时间为15h～22h，得到胶体金标记的猫SAA抗体；
S3、胶体金标记的猫SAA抗体的纯化：先以2000rpm的转速对所述胶体金标记的猫SAA抗体进行离心，弃去第一沉淀，保留第一上清液，再以10000rpm的转速对所述第一上清液进行离心，弃掉第二上清液，将第二沉淀用pH值为7.2的1mol/LPBS缓冲溶液1ml重悬，得到胶体金标记的猫SAA抗体，4℃保存备用。


6.如权利要求5所述的检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，步骤S2中，所述猫...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱翀，孙云雷，冯小龙，张施羽，李婷，王蓉蓉，
申请(专利权)人：爱若维生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32