一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法，本申请涉及的扩增反应体系，有利于实验开展，降低污染率，检测结果更准确，同时稳定性更好，有利于长期保存；本申请涉及的引物是通过大量实验筛选得出，引物具有良好的特异性；本申请涉及的试剂盒及检测方法可以准确区分含有羊布鲁氏菌病毒与不含羊布鲁氏菌病毒的样本，从而对后续治疗提出建议，适合养殖单位和进出口检疫部门使用，实验流程简单，适合普通从业人员使用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及动物检验检疫
，尤其涉及一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。
技术介绍
布鲁氏菌病，简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁，我国将其列为二类动物疫病。布病国内传染源主要为羊，其次为牛和猪。布鲁氏菌病的发病原因主要由环境因素和人为因素组成：环境因素：在牛羊养殖过程中，动物的生长环境对其自身健康安全有重要影响。倘若养殖场的养殖条件不适合动物生长习性，且禽畜本身适应性较低时，会损害动物的健康，甚至会降低养殖场户的养殖效益。除此之外，当外界天气恶化亦或空气中湿度高达60％～90％时，湿热环境很容易滋生各种霉菌，导致牛羊自身处于亚健康状态，使免疫力不断下降，为动物疾病的发生和传播创造了条件。人为因素：在牛羊养殖过程中，极易感染布病，如：病畜接生、剥牛羊皮、剪打羊毛、挤乳、切病毒肉、屠宰病畜、儿童玩羊等均可受染，病菌从接触处的破损皮肤进入人体；实验室工作人员常可由皮肤、黏膜感染细菌；进食染菌的生乳、乳制品和未煮沸病畜肉类时，病菌可自消化道进入体内。此外，病菌也可通过呼吸道黏膜、眼结膜和性器官黏膜而发生感染。因此，随着养殖场建设规模和建设数量的持续增加，需重视动物疾病预防和控制，建立完善的养殖设施和消毒设备，否则会增加疾病的发生率，给企业带来难以预估的经济损失。2019年中国布鲁氏菌病发病数量为44036例，死亡人数为1人；2020年1-8月中国布鲁氏菌病发病数量为35112例，死亡人数为1人。我国曾设立21个检测点，对573032位职业人群展开调查，血清学检测196636人，检出阳性39190例，平均阳性率为18.11％。检测点菌164株，结合部分送检菌株，在全部276株菌种，羊布鲁氏菌占74％，还有16％菌株待鉴定，说明引起我国布鲁氏菌病疫情的优势菌株是羊布鲁氏菌。布鲁氏菌病的诊断是布鲁氏菌病的研究重点和难点，目前，我国针对羊布鲁氏病，采取的检测方法主要有：RBPT(虎红平板凝集试验法)、CFT(补体结合试验法)、SAT(试管凝集试验法)、ELISA(酶联免疫法)、多重PCR等，其中RBPT用于初次筛选，而CFT和SAT主要用于诊断定性，SAT易有假阴性和假阳性，会给诊断带来影响，而CFT操作起来比较复杂，其要求检测者要具备一定的能力，不利于布病净化，ELISA一般多用于检测抗体，且灵敏度不高，而PCR灵敏度高，但操作繁琐，设备贵，反应时间长，不利于快检。因此，研究一种快速、特异、灵敏的检测方法应用到布鲁氏菌病的诊断中是非常迫切的。
技术实现思路
本申请的目的是克服现有技术的缺陷，提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。为实现上述目的，本申请提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；所述的引物序列如下：外引物F3-1的序列为：TGGCGTTCCTTGTACAGC；外引物B3-1的序列为：GCCATTATGGTGACTGTCCG；内引物FIP-1的序列为：CTCAAGGCAACGGCTCAGATCACTCCAGTCGATTGTTGGGAC；内引物BIP-1的序列为：GTGATCGGCATCATAGGCTGCATTCTATCCGGCTTGAAGGGT；环引物LB-1的序列为：TCAGCAATGACATGCCCCA；环引物LF-1的序列为：TCAATCCAACACGTTCCAGT。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2；所述的引物序列如下：外引物F3-2的序列为：AATGACATGCCCCACACC；外引物B3-2的序列为：TCGAAAGTCCACGCAGATG；内引物FIP-2的序列为：TCGGCCTACCGCTGCGAATAACTTGAAGCTTGCGGACAGT；内引物BIP-2的序列为：ACAGCATGCAGCTTGGTCGTGCAAAAGGGGGGCTGAAG。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF-3；所述的引物序列如下：外引物F3-3的序列为：TTGTACAGCCTCCAGTCGA；外引物B3-3的序列为：CATTATGGTGACTGTCCGCA；内引物FIP-3的序列为：GGCCTTCATTGCCAGCAATCTCTGTTGGGACACTGGAACGT；内引物BIP-3的序列为：AGTGATCGGCATCATAGGCTGCTCTATCCGGCTTGAAGGGT；环引物LB-3的序列为：ATCAGCAATGACATGCCCCA；环引物LF-3的序列为：CTCAGATCAAGGTCAATCCAAC。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，所述反应液包括上述所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物。作为本申请的进一步改进，所述扩增反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、TritonX-100、BstDNA聚合酶。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及8联排检测管，所述检测管设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为0.9％的生理盐水，所述阳性对照溶液中含有羊布鲁氏菌基因非传染DNA片段，所述扩增反应液为上述所述的扩增反应液。作为本申请的进一步改进，所述洗涤液为0.9％的生理盐水。作为本申请的进一步改进，所述核酸染料为SYBRGreen。作为本申请的进一步改进，所述裂解液为TRIZOL。为实现上述目的，本申请还提供了一种应用上述所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含模板DNA的样本溶液；S3、加样反应：取若干检测管分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本测样管，依次将阴性对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；所述的引物序列如下：/n外引物F3-1的序列为：TGGCGTTCCTTGTACAGC；/n外引物B3-1的序列为：GCCATTATGGTGACTGTCCG；/n内引物FIP-1的序列为：/nCTCAAGGCAACGGCTCAGATCACTCCAGTCGATTGTTGGGAC；/n内引物BIP-1的序列为：/nGTGATCGGCATCATAGGCTGCATTCTATCCGGCTTGAAGGGT；/n环引物LB-1的序列为：TCAGCAATGACATGCCCCA；/n环引物LF-1的序列为：TCAATCCAACACGTTCCAGT。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；所述的引物序列如下：
外引物F3-1的序列为：TGGCGTTCCTTGTACAGC；
外引物B3-1的序列为：GCCATTATGGTGACTGTCCG；
内引物FIP-1的序列为：
CTCAAGGCAACGGCTCAGATCACTCCAGTCGATTGTTGGGAC；
内引物BIP-1的序列为：
GTGATCGGCATCATAGGCTGCATTCTATCCGGCTTGAAGGGT；
环引物LB-1的序列为：TCAGCAATGACATGCCCCA；
环引物LF-1的序列为：TCAATCCAACACGTTCCAGT。


2.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2；所述的引物序列如下：
外引物F3-2的序列为：AATGACATGCCCCACACC；
外引物B3-2的序列为：TCGAAAGTCCACGCAGATG；
内引物FIP-2的序列为：
TCGGCCTACCGCTGCGAATAACTTGAAGCTTGCGGACAGT；
内引物BIP-2的序列为：
ACAGCATGCAGCTTGGTCGTGCAAAAGGGGGGCTGAAG。


3.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF-3；所述的引物序列如下：
外引物F3-3的序列为：TTGTACAGCCTCCAGTCGA；
外引物B3-3的序列为：CATTATGGTGACTGTCCGCA；
内引物FIP-3的序列为：
GGCCTTCATTGCCAGCAATCTCTGTTGGGACACTGGAACGT；
内引物BIP-3的序列为：
AGTGATCGGCATCATAGGCTGCTCTATCCGGCTTGAAGGGT；
环引物LB-3的序列为：ATCAGCAATGACATGCCCCA；
环引物LF-3的序列为：CTCAGATCAAGGTCAATCCAAC。


4.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蓉蓉，赵肖，孙云雷，冯小龙，郭珊，施斌彬，
申请(专利权)人：爱若维生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32