一种用于犬副流感LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于犬副流感LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法，该试剂盒及检测方法可以准确区分含有犬副流感病毒与不含犬副流感病毒的样本，即进行LAMP特异性检测后，表明设计引物的特异性良好。本申请的试剂盒及检测方法能快速、准确的检测出犬副流感病毒，通过目测或仪器观察结果，数据处理简单，成本低，对临床检测有重要意义，特别适合畜牧场使用，检测实惠，可大量推广。

【技术实现步骤摘要】
一种用于犬副流感LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及动物检验检疫
，尤其涉及一种用于犬副流感LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。
技术介绍
犬副流感(CPIV)是由副流感病毒Ⅱ型引起的，以急性呼吸道炎症为主要症状的犬的病毒性传染病。副流感病毒Ⅱ型为副黏病毒科、副黏病毒属的成员，还可引起急性脑脊髓炎和脑内积水，临床表现后躯麻痹和运动失调等症状。其病毒粒子表面含有血凝素和神经氨酸酶，可凝集人类O型、鸡、豚鼠、大鼠、兔、犬、猫和羊的红细胞。该病毒对理化因素的抵抗力不强，在无蛋白质的液体培养基中，室温或4℃经2～4小时几乎失去感染力，在pH值为3和37℃下活力也下降，对氯仿和乙醚敏感、季铵盐类是有效的消毒剂。副流感病毒Ⅱ可感染各种年龄、性别和品种的犬，但幼龄、体弱和处于应激状态的犬多发，且病情较重，病程1～4周不等，死亡率可达60％。常突然发生，传播迅速，且常与近期发病犬或带毒犬接触有关。急性期病犬是最主要的传染源。自然感染途径主要是呼吸道。CPIV突然发生时，病初发热，体温升高达40℃以上，单侧或双侧鼻孔流出大量黏液性或不透明分泌物，严重的病犬有间歇性咳嗽，肺呼吸音粗厉。病犬精神不振，食欲减少，一般1周左右病情好转。如有继发感染，则病程延长，病情加重，咳嗽持久而不愈，甚至死亡。少数病犬可呈现出血性肠炎、后躯麻痹和运动失调等症状。可见鼻孔周围有浆液性或黏液脓性鼻漏、结膜炎。剖检可见扁桃体炎，气管、支气管炎，有时肺部有点状出血。神经型主要表现为急性脑脊髓炎和脑内积水，整个中枢神经系统和脊髓均有病变，前叶灰质最为严重。随着国民生活水平的提高，宠物犬饲养量逐年上升，因此对犬和犬主人的健康保驾护航，加强犬副流感的检测及防治非常重要。迄今，国际上用于犬副流感检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定、RT-PCR、胶体金试纸条等。而针对抗体的检测方法有免疫荧光法、ELISA、中和实验和血凝抑制试验等，但这些方法局限性很大，RT-PCR所需设备昂贵，操作繁琐，胶体金试纸条敏感性和特异性弱，容易假阳结果出现，ELISA用于检测抗体，检测时间长且敏感性不强。因此，研究一种快速、特异、灵敏的恒温扩增检测方法，以应用到犬副流感病毒的诊断中是非常迫切的。
技术实现思路
本申请的目的是克服现有技术的缺陷，提供了一种用于犬副流感LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。为实现上述目的，本申请提供了一种用于犬副流感LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及一条环引物LB-1；所述的引物序列如下：外引物F3-1的序列为：GGCATATGAGCGATTCACA；外引物B3-1的序列为：AGCGATGAGAATCCCTTG；内引物FIP-1的序列为：CGGTTTTAGTGTTGTAGGTGGGACTCACTCAAGAACTGCAAGA；内引物BIP-1的序列为：ACTAACCTCTAATAACCCAGAGCTTGAGAACAATCCGTAGGC；环引物LB-1的序列为：AGATCTCGGCTTCTTCTATTCT。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于犬副流感LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2，以及一条环引物LB-2；所述的引物序列如下：外引物F3-2的序列为：TCATCGCTTTGGAGCATTA；外引物B3-2的序列为：GCATTGATCTCTCCACGG；内引物FIP-2的序列为：GGTGACTGGTCAGCTAATTTGACTACAATGTTTTCACTACCATCA；内引物BIP-2的序列为：GAAGCTGATATCGAAAGGGTAGAGACTCATACCTGAACGAGCA；环引物LB-2的序列为：GCTTTGAGGAGGGATCATTCCG。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于犬副流感LAMP检测的引物，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF；所述的引物序列如下：外引物F3-3的序列为：AGTTTGGGCAATTTTTCGT；外引物B3-3的序列为：AGAAGCCGAGATCTTAGCT；内引物FIP-3的序列为：AGTTCTTGAGTGAGTGTGAATCGCCCCGACACAAAAATGTC；内引物BIP-3的序列为：GCAAGATCAGAGTGAGGAAGGTTAGAGGTTAGTATAAATACCCTGA；环引物LB-3的序列为：ACAATCCCACCTACAACACTAAAAC；环引物LF的序列为：TCATATGCCTTAAGCACGGA。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于犬副流感LAMP检测的扩增反应液，所述反应液包括上述所述的用于犬副流感LAMP检测的引物。作为本申请进一步的改进，所述反应液还包括Thermopolbuffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱以及BstDNA聚合酶，其中：所述Thermopolbuffer内含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4以及TritonX-100。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于犬副流感LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及8联排检测管，所述检测管设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液和核酸染料，所述阴性对照溶液为0.9％的生理盐水，所述阳性对照溶液中含有1-104copies/mL犬副流感病毒基因片段的非传染性DNA，所述扩增反应液为权利要求4-5任意一项所述的扩增反应液。作为本申请进一步的改进，所述洗涤液为0.9％的生理盐水。作为本申请进一步的改进，所述核酸染料为SYBRGreen。作为本申请进一步的改进，所述裂解液为TRIZOL。为实现上述目的，本申请还提供了一种应用上述所述的用于犬副流感LAMP检测的试剂盒的的检测方法，包括如下步骤：S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含模板RNA的样本溶液，再利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA的样本溶液；S3、加样反应：取若干检测管分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本测样管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的样本溶液分别加入阴性对照管、阳性对照管和样本测样管中，并使各所述检测管中的溶液充分混合均匀，离心使液体集中的到各所述检测管的底部，再将检测管置于60℃～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于犬副流感LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及一条环引物LB-1；所述的引物序列如下：/n外引物F3-1的序列为：GGCATATGAGCGATTCACA；/n外引物B3-1的序列为：AGCGATGAGAATCCCTTG；/n内引物FIP-1的序列为：/nCGGTTTTAGTGTTGTAGGTGGGACTCACTCAAGAACTGCAAGA；/n内引物BIP-1的序列为：/nACTAACCTCTAATAACCCAGAGCTTGAGAACAATCCGTAGGC；/n环引物LB-1的序列为：AGATCTCGGCTTCTTCTATTCT。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于犬副流感LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及一条环引物LB-1；所述的引物序列如下：
外引物F3-1的序列为：GGCATATGAGCGATTCACA；
外引物B3-1的序列为：AGCGATGAGAATCCCTTG；
内引物FIP-1的序列为：
CGGTTTTAGTGTTGTAGGTGGGACTCACTCAAGAACTGCAAGA；
内引物BIP-1的序列为：
ACTAACCTCTAATAACCCAGAGCTTGAGAACAATCCGTAGGC；
环引物LB-1的序列为：AGATCTCGGCTTCTTCTATTCT。


2.一种用于犬副流感LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2，以及一条环引物LB-2；所述的引物序列如下：
外引物F3-2的序列为：TCATCGCTTTGGAGCATTA；
外引物B3-2的序列为：GCATTGATCTCTCCACGG；
内引物FIP-2的序列为：
GGTGACTGGTCAGCTAATTTGACTACAATGTTTTCACTACCATCA；
内引物BIP-2的序列为：
GAAGCTGATATCGAAAGGGTAGAGACTCATACCTGAACGAGCA；
环引物LB-2的序列为：GCTTTGAGGAGGGATCATTCCG。


3.一种用于犬副流感LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF；所述的引物序列如下：
外引物F3-3的序列为：AGTTTGGGCAATTTTTCGT；
外引物B3-3的序列为：AGAAGCCGAGATCTTAGCT；
内引物FIP-3的序列为：
AGTTCTTGAGTGAGTGTGAATCGCCCCGACACAAAAATGTC；
内引物BIP-3的序列为：
GCAAGATCAGAGTGAGGAAGGTTAGAGGTTAGTATAAATACCCTGA；
环引物LB-3的序列为：ACAATCCCACCTACAACACTAAAAC；
环引物LF的序列为：TCATATGCCTTAAGCACGGA。


4.一种用于犬副流感LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蓉蓉，冯小龙，孙云雷，
申请(专利权)人：爱若维生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32