一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法，进行LAMP特异性检测后，表明设计引物的特异性良好，能准确区分含有非洲马瘟病毒与不含非洲马瘟病毒的样本，且可视化染料检测法，显色效果更明显，染料在扩增前就加入到反应体系中，还可以避免气溶胶污染，可以准确、快速的检验非洲马瘟病毒，成本低，可推广性高，市场应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及动物检验检疫
，尤其涉及一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。
技术介绍
非洲马瘟(Africanhorsesickness，AHS)是马科动物的一种由节肢动物传播的非接触性传染病，被世界卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国也将其确定为进境动物一类传染病，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速。病原为非洲马瘟病毒(AHSV)，该病原属于呼肠孤病毒科环状病毒属(Orbivirusgenus，Reoviridae)。环状病毒属不同的血清群可根据主要的群特异性抗原VP7的抗原性来鉴别。对于易感马群，感染本病后致死率可达95％。以呼吸系统和循环系统的病理变化为特征；骡的易感性稍差，而驴感染后很少发生死亡。斑马感染后通常不出现症状，可成为自然贮存宿主携带和传播病原。病原的传播媒介为Cullicoidesspecies。目前已发现非洲马瘟病毒具有9个血清型。与环状病毒的原型病毒——蓝舌病(BTV)相似，非洲马瘟病毒没有囊膜，具有3层呈二十面体对称的衣壳。病毒基因组包含10个dsRNA片段，编码10种蛋白，其中的7种为结构蛋白和4种非结构蛋白。病毒粒子的外衣壳由VP2和VP5组成，内衣壳由VP3和VP7组成，其中VP7为主要的内衣壳蛋白，在9个血清型的病毒中最为保守，为群特异性抗原蛋白。对AHSV感染马匹和免疫接种马匹进行快速的实验室评价对决定是否对马匹进行运输极为重要。目前已有一些研究致力于建立可检测AHSV和其抗体的ELISA方法，VP7抗原稳定而且不具有感染性，适合于作为ELISA检测的抗原。用可溶性AHSV抗原或重组VP7的间接ELISA检测方法，已被证明是一种检测AHSV群特异性抗体的好方法，特别适用于大量筛查。但该方法依然存在一些缺点：检测费时，只能用于抗体检测，敏感性不高，操作复杂，需要较多仪器设备等。现有专利CN100376688C公布的检测AHSV特异性核酸的方法是反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，它将高敏感性、高特异性和高准确性结为一体，但是操作复杂，需要专业设备和高水平技术人员，且检测时间较长，不利于基层推广使用。因此，研究建立特异、敏感、快速、低成本的AHSV核酸检测方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等人专利技术的新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。但是迄今为止，用于检测非洲马瘟病毒的LAMP引物与试剂盒在国内外尚未见报道。
技术实现思路
本申请的目的是克服现有技术的缺陷，提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法。为实现上述目的，本申请提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB1；所述的引物序列如下：外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；内引物FIP的序列为：CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；内引物BIP的序列为：ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；环引物LB1的序列为：GTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB2；所述的引物序列如下：外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；内引物FIP的序列为：CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；内引物BIP的序列为：ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；环引物LB2的序列为：AAGTGTTATGGTATACGTCCTTGGA。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB3；所述的引物序列如下：外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；内引物FIP的序列为：CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；内引物BIP的序列为：ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；环引物LB3的序列为：AGTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的扩增反应液，所述反应液为上述所述的用于非洲马瘟LAMP检测的引物。作为本申请进一步的方案，所述反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、TritonX-100以及BstDNA聚合酶。为实现上述目的，本申请还提供了一种用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及八级联排检测管，所述检测管上设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为无非洲马瘟病毒基因非传染DNA片段溶液，所述阳性对照溶液为含有非洲马瘟病毒基因非传染DNA片段溶液，所述扩增反应液为上述所述的扩增反应液。作为本申请进一步的方案，所述洗涤液为4％的NaOH溶液。作为本申请进一步的方案，所述核酸染料为GeneFinder、SYBRGreen、GelRed中的任意一种。作为本申请进一步的方案，所述稳定液为石蜡油。为实现上述目的，本申请还提供了一种应用上述所述的用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含样本模板RNA的溶液，再利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA的样本溶液；S3、加样反应：取若干检测管并分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本检测管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的cDNA样本溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB1；所述的引物序列如下：/n外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；/n外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；/n内引物FIP的序列为：/nCCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；/n内引物BIP的序列为：/nATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；/n环引物LB1的序列为：GTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB1；所述的引物序列如下：
外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；
外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；
内引物FIP的序列为：
CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；
内引物BIP的序列为：
ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；
环引物LB1的序列为：GTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。


2.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB2；所述的引物序列如下：
外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；
外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；
内引物FIP的序列为：
CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；
内引物BIP的序列为：
ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；
环引物LB2的序列为：AAGTGTTATGGTATACGTCCTTGGA。


3.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB3；所述的引物序列如下：
外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；
外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；
内引物FIP的序列为：
CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；
内引物BIP的序列为：
ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；
环引物LB3的序列为：AGTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。


4.一种用于非洲马瘟LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述反应液为权利要求1-3任意一项中所述的用于非洲马瘟LAMP检测的引物。


5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蓉蓉，冯小龙，孙云雷，
申请(专利权)人：爱若维生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32