RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒，引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC，所述下游引物序列为CAAGTGGTAAGTTCCGGTCATCAATTACCGTTC。本发明专利技术采用上述的一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场检测。

【技术实现步骤摘要】
RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒
本专利技术涉及单增李斯特菌分子检测
，尤其是涉及一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)简称“单增李斯特菌”，是一种常见的土壤中的腐生菌，革兰氏反应为阳性，且为兼性厌氧菌，是目前国际上确认的7种李斯特菌中唯一能引起人畜共患病的食源性致病菌，该菌属在食源性细菌中毒案例中占主要地位。被该菌感染后，血液内会出现单核细胞增多的现象，故将其命名为单核细胞增生李斯特氏菌。单增李斯特菌能产生一种溶血素性质的外毒素，对外界环境具有较强的耐受性，主要通过乳及乳制品、蔬菜、水产品、肉制品等传播，使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、单核细胞增多及造成孕妇流产、死胎等疾病，病死率高达20％-30％。其中，病人及无症状携带者也可称为传染源。WTO已将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。单增李斯特菌作为食品检测的一项重要指标，在公共卫生、口岸检疫和畜牧兽医上有重要的意义。目前，单增李斯特菌的检测方法包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。传统的单增李斯特菌检测方法由于检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已经远远不能满足现代的检测要求，这不仅给检验部门带来沉重的负担，而且还使生产部门产品运转和仓储的时间延长，费用增加。分子生物学方法如核酸探针技术、基因芯片技术、聚合酶链式反应(PCR)以及等温核酸技术中的LAMP法已经建立起来，且在沙门氏菌的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。应用探针技术可以在短期内处理大量样品，但其敏感性尚不够高、加之常常需要放射性标记，操作比较繁琐费时，因而限制了其应用。PCR技术如实时定量PCR、多重PCR以其高度的特异性及敏感性在单增李斯特菌检测方面取得了重大的突破，但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。LAMP方法克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于单增李斯特菌的检测。但是，LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场检测。为实现上述目的，本专利技术提供了一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物，引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC，所述下游引物序列为CAAGTGGTAAGTTCCGGTCATCAATTACCGTTC。一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的探针，所述探针序列为5’端序列/荧光报告基团/A/THF/淬灭基团/3’端序列，其中：所述5’端的核苷酸序列为：CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAAT；所述3’端的核苷酸序列为：TAATGTTTACGCYAAAG；所述THF为1个碱基位置；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。优选的，所述探针的核苷酸序列为CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAATATTAATGTTTACGCYAAAG。一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的试剂盒，试剂盒包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品、引物和探针。引物为RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物，探针为RAA荧光法检测单增李斯特菌的探针。优选的，所述引物中上游引物和下游引物的浓度均为0.05-0.1mmol/L。优选的，所述探针的浓度为0.02-0.05mmol/L。优选的，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为500mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)、浓度为240mmol/L的MgAc和质量分数为10％的PEG10000。优选的，所述阳性质控品中含有单增李斯特菌的基因组DNA；所述单增李斯特菌的基因组DNA的浓度为1×106Copies/ul。优选的，所述阴性质控品为ddH2O或纯化水。因此，本专利技术采用上述一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场检测。本专利技术基于重组酶介导的等温核酸扩增技术(简称为RAA技术)设计特异引物和探针，并建立RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒，能方便快速准确地鉴定单增李斯特菌，操作简便，检测时间短，15min内即可完成，无需通过高温使DNA解旋，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。本专利技术的试剂盒检测时方法快速、灵敏、高效并且能实现高通量，降低了检测时间和检测成本。本专利技术的试剂盒检测单增李斯特菌时与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10Copies。并且，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。附图说明图1是本专利技术一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒中不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果；图2是本专利技术一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒中单增李斯特菌质粒DNA重复性检测结果；图3是本专利技术一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物、探针和试剂盒中单增李斯特菌的特异性检测结果。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的试剂盒，试剂盒包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品、引物和探针。一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物，引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC，下游引物序列为CAAGTGGTAAGTTCCGGTCATCAATTACCGTTC。引物中上游引物和下游引物的浓度均为0.05-0.1mmol/L。一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的探针，探针序列为5’端序列/荧光报告基团/A/THF/淬灭基团/3’端序列，探针的浓度为0.02-0.05mmol/L。其中：5’端的核苷酸序列为：CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAAT；3’端的核苷酸序列为：TAATGTTTACGCYAAAG；THF为1个碱基位置；荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。探针核苷酸序列为CGTCCATCTATTTGCCWGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物，其特征在于：引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC，所述下游引物序列为CAAGTGGTAAGTTCCGGTCATCAATTACCGTTC。/n

【技术特征摘要】
1.一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的引物，其特征在于：引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC，所述下游引物序列为CAAGTGGTAAGTTCCGGTCATCAATTACCGTTC。


2.一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的探针，其特征在于：所述探针序列为5’端序列/荧光报告基团/A/THF/淬灭基团/3’端序列，
其中：所述5’端的核苷酸序列为：CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAAT；
所述3’端的核苷酸序列为：TAATGTTTACGCYAAAG；
所述THF为1个碱基位置；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；
所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。


3.根据权利要求2所述的一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAATATTAATGTTTACGCYAAAG。


4.一种RAA荧光法检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括RAA基...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔荣飞，
申请(专利权)人：石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心石家庄市畜产品质量研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13