抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其是对抗生素耐药基因位点进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，再根据结果中与隐性菌株对比所显示的循环阈值Ct值，判定样本中是否含有该耐药基因；所述抗生素为碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素。本发明专利技术可以对碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素的耐药基因进行有效的检测，不需要经过菌种的分离、培养，2

【技术实现步骤摘要】
抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法


[0001]本专利技术涉及本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]第一方面，碳青霉烯类抗生素具有广谱、强效、对绝大多数β-内酰胺酶高度稳定、对头孢菌素耐药菌仍可发挥优良抗菌作用的特点。细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而碳青霉烯类抗生素对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性，是治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的常用抗菌药物之一。碳青霉烯类抗生素在大多数情况下耐受性良好，不良反应发生率较低，适用于严重的革兰阴性菌感染、混合感染、耐药菌感染和免疫缺陷者感染，在抗菌治疗中基本处于最后一道防线的地位但随着广谱抗生素的广泛使用，世界各地陆续出现了产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行，给临床带来了极大的麻烦，因其对临床常用的广谱抗生素均耐药，由此引发的感染往往无药可救，病死率极高。而且耐药菌株一旦无法及时清除，就有可能通过克隆传播引起交叉感染，至造成院内感染的暴发流行。另外，由于肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药主要由质粒介导，耐药基因容易随质粒在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散。因此快速、准确的早期诊断是预防及控制耐药株暴发流行、延缓耐药性的发展的关键。
[0003]常见的碳青霉烯类耐药检测方法有纸片扩散法、稀释法、Etest(表型确认)、改良Hodge实验、自动化药敏检测(VITEK 2系统、BD Phoenix、ATB系统)等。但纸片扩散法和稀释法影响因素多，操作技术误差大；Etest和自动化药敏检测价格昂贵，抗生素选择自由度差，不适用于国内较大规模的基层临床单位开展。qPCR检测技术具有快速、准确、低成本等特点，适用于碳青霉烯类抗生素耐药基因的高通量检测。
[0004]第二方面，喹诺酮类药物是20世纪60年代研制的一类合成抗菌药。自临床应用以来,其疗效已得到人们的认可,特别是氟喹诺酮类药物更受到人们的青睐。该类药物对包括金黄色葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌和包括绿脓杆菌在内的革兰氏阴性菌,以及支原体、衣原体等都显示出了良好的抗菌活性。近年来,某些喹诺酮类药物作为治疗结核病的替代药物也取得了令人满意的效果,因此,临床上对该类药物的使用已十分普遍,用于兽医临床的也已有十余种。但随着该类抗生素的大量应用，细菌对喹诺酮类药物的耐药性越来越严重。
[0005]其中，质粒介导的喹诺酮耐药基因的迁移极大地推进了喹诺酮耐药性在细菌间的传播，目前已发现的可在细菌间迁移的喹诺酮耐药基因有8个，包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6
’
)-Ib和aac(6
’
)-Ib-cr。对具有迁移性的喹诺酮耐药基因进行筛查，是评估细菌菌株耐药程度和耐药迁移风险的基础，利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、多重PCR技术和基因芯片技术等，可完成耐药基因的筛查。qPCR检测技术具有快速、准确、低成本等特点，也适用于喹诺酮类抗生素耐药基因的高通量检测。
[0006]第三方面，氨基苷类(aminoglycosides)抗生素是由二个或三个氨基糖分子和一个非糖部分称苷元的氨基环醇通过醚键连接而成，分为天然和半合成两大类。天然来源的包括由链霉菌属培养液中提取获得的链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、大观霉素等，由小单孢菌属培养液中提取获得的庆大霉素、西索米星、小诺米星等。人工半合成的主要有阿米卡星、奈替米星等。在临床使用广泛，主要用于治疗需氧革兰氏阴性杆菌造成的感染、结核杆菌造成的感染以及绿脓杆菌造成的感染。此外氨基糖苷类药物还可以与青霉素或万古霉素联合治疗链球菌感染。
[0007]目前发现的氨基糖苷耐药基因主要有：aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6
’
)-Ib、aac(6
’
)-II、ant(3”)-I、ant(2”)-I和aph(3
’
)-VIa。对氨基糖苷耐药基因进行筛查，是评估细菌菌株耐药程度和耐药迁移风险的基础，利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、多重PCR技术和基因芯片技术等，可完成耐药基因的筛查。qPCR检测技术具有快速、准确、低成本等特点，同样适用于氨基糖苷类抗生素耐药基因的高通量检测。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提出一种高通量、特异、敏感、快速的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法。
[0009]所采用的技术方案为：
[0010]一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其是对抗生素耐药基因位点进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，再根据结果中与隐性菌株对比所显示的循环阈值Ct值，判定样本中是否含有该耐药基因；所述抗生素为碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素。
[0011]进一步地，该抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，具体包括如下步骤：
[0012]S1、首先从NCBI数据库筛选并下载与对应种类抗生素耐药相关的主要基因序列，并根据主要基因突变位点上下游，通过比对序列选择保守区域设计引物；当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，主要基因是DIM、IMP、KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、SIM、VIM基因；当抗生素为喹诺酮类抗生素时，主要基因是qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6
’
)-Ib和aac(6
’
)-Ib-cr；当抗生素为氨基糖苷类抗生素时，主要基因是aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6
’
)-Ib、aac(6
’
)-II、ant(3”)-I、ant(2”)-I和aph(3
’
)-VIa；
[0013]S2、样本中细菌基因组DNA的提取，采用裂解液与样本以1：1的体积比混合，沸水中水浴10min，放置于4℃冰箱30min，期间每隔10min摇晃一下离心管，离心后取上清液备用；
[0014]S3、对相关的主要基因进行qPCR及溶解曲线扩增；
[0015]S4、根据qPCR反应结果中的每个基因的Ct值判定样品中是否含有该耐药基因。
[0016]进一步地，S1中，当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：
[0017]KPC-F的序列为SEQ ID NO.1；
[0018]KPC-R的序列为SEQ ID NO.2；
[0019]NDM1-F的序列为SEQ ID NO.3；
[0020]NDM1-R的序列为SEQ ID NO.4；
[0021]OXA23-F的序列为SEQ ID NO.5；
[0022]OXA23-R的序列为SEQ ID NO.6；
[0023]OXA48-F的序列为SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对抗生素耐药基因位点进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，再根据结果中与隐性菌株对比所显示的循环阈值Ct值，判定样本中是否含有该耐药基因；所述抗生素为碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素。2.根据权利要求1所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、首先从NCBI数据库筛选并下载与对应种类抗生素耐药相关的主要基因序列，并根据主要基因突变位点上下游，通过比对序列选择保守区域设计引物；当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，主要基因是DIM、IMP、KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、SIM、VIM基因；当抗生素为喹诺酮类抗生素时，主要基因是qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6
’
)-Ib和aac(6
’
)-Ib-cr；当抗生素为氨基糖苷类抗生素时，主要基因是aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6
’
)-Ib、aac(6
’
)-II、ant(3”)-I、ant(2”)-I和aph(3
’
)-VIa；S2、样本中细菌基因组DNA的提取，采用裂解液与样本以1：1的体积比混合，沸水中水浴10min，放置于4℃冰箱30min，期间每隔10min摇晃一下离心管，离心后取上清液备用；S3、对相关的主要基因进行qPCR和溶解曲线扩增；S4、根据qPCR反应结果中的每个基因的Ct值判定样品中是否含有该耐药基因。3.根据权利要求2所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，S1中，当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：KPC-F的序列为SEQ ID NO.1；KPC-R的序列为SEQ ID NO.2；NDM1-F的序列为SEQ ID NO.3；NDM1-R的序列为SEQ ID NO.4；OXA23-F的序列为SEQ ID NO.5；OXA23-R的序列为SEQ ID NO.6；OXA48-F的序列为SEQ ID NO.7；OXA48-R的序列为SEQ ID NO.8；OXA51-F的序列为SEQ ID NO.9；OXA51-R的序列为SEQ ID NO.10；IMP-F的序列为SEQ ID NO.11；IMP-R的序列为SEQ ID NO.12；VIM-F的序列为SEQ ID NO.13；VIM-R的序列为SEQ ID NO.14；SIM-F的序列为SEQ ID NO.15；SIM-R的序列为SEQ ID NO.16；DIM-F的序列为SEQ ID NO.17；DIM-R的序列为SEQ ID NO.18；当抗生素为喹诺酮类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：qnrA-F的序列为SEQ ID NO.19；qnrA-R的序列为SEQ ID NO.20；
qnrB-F的序列为SEQ ID NO.21；qnrB-R的序列为SEQ ID NO.22；qnrC-F的序列为SEQ ID NO.23；qnrC-R的序列为SEQ ID NO.24；qnrD-F的序列为SEQ ID NO.25；qnrD-R的序列为SEQ ID NO.26；qnrS-F的序列为SEQ ID NO.27；qnrS-...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚正华，盛才敏，夏震遥，牛群，唐加林，唐敏，
申请(专利权)人：深圳市研元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：