用于寡核苷酸治疗剂的大规模平行发现方法技术

本发明专利技术涉及治疗性寡核苷酸分析和发现领域，并提供了用于对修饰的寡核苷酸进行基于引物的平行测序的方法，所述方法提供可用于寡核苷酸治疗性发现、制造、质量保证、治疗性开发和患者监测的基于序列的质量信息。患者监测的基于序列的质量信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于寡核苷酸治疗剂的大规模平行发现方法


[0001]本专利技术涉及治疗性寡核苷酸分析和发现领域，并提供了用于对修饰的寡核苷酸进行基于引物的平行测序的方法，所述方法提供可用于寡核苷酸治疗性发现、制造、质量保证、治疗性开发和患者监测的基于序列的质量信息。

技术介绍

[0002]EP 1 914 317 A1公开了一种用于定性和定量检测长度为约8至50个核苷酸的短核酸序列的方法。该方法采用重叠捕获探针和聚合酶延伸的杂交。EP'317的实例使用DNA硫代磷酸酯寡核苷酸G3139。
[0003]WO 01/34845 A1公开了一种用于从体液或提取物中定量硫代磷酸酯寡核苷酸的方法。该方法采用与寡核苷酸部分杂交的捕获探针，然后对捕获探针/寡核苷酸杂交体进行酶标记，然后检测标记。WO'845的实例使用DNA硫代磷酸酯寡核苷酸ISIS 2302。
[0004]Caifu等人，NAR 33(2005)E179公开了使用基于捕获探针/PCR的扩增系统检测和定量未修饰的短寡核苷酸，诸如microRNA。
[0005]Froim等人，VAR(1995)4219-4223公开了用于通过具有UV检测的毛细管电泳进行硫代磷酸酯反义DNA测序的方法。
[0006]Tremblay等人，Bioanalysis(2011)3(5)公开了一种基于双连接的杂交测定，用于特异性测定寡核苷酸治疗药物，并用于特异性测定实施定量PCR的复杂混合物中的单个代谢物。
[0007]WO2007/025281公开了一种用于使用捕获探针杂交、连接和扩增来检测短寡核苷酸的方法。
[0008]Cheng等人，Molecular Therapey Nucleic Acids(2013)e67公开了用于鉴定脑穿透适体的体内指数富集的配基系统进化技术(selex)。适体是2'氟修饰的磷酸二酯寡核苷酸，使用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)或Superscript III逆转录酶进行第一链合成，通过Sanger测序或Illumina测序进行测序。
[0009]Crouzier等人，PLoS ONE(2012)e359900涉及使用Superscript III有效逆转录锁定的核酸核苷酸，以产生抗核酸酶的RNA适体。Crouzier等人使用基于Sanger的测序对从LNA适体寡核苷酸的第一链合成获得的PCR扩增产物进行测序。值得注意的是，LNA适体在另外的RNA磷酸二酯核苷背景中具有单个LNA核苷。
[0010]本专利技术人已经提供了3'捕获探针连接和基于聚合酶对修饰的寡核苷酸(诸如2'-O-MOE和LNA修饰的寡核苷酸)的检测，其能够对此类修饰的寡核苷酸进行大规模平行测序。先前，如PCT/EP2017/078695中所述，专利技术人已经开发了一种方法，用于检测、定量、扩增、测序或克隆核苷修饰的寡核苷酸(诸如LNA修饰的寡核苷酸)，该方法基于使用捕获探针对修饰的寡核苷酸进行3'捕获，然后对核苷修饰的寡核苷酸进行链延伸以及检测、定量、扩增、测序或克隆。PCT/EP2017/078695公开了Volcano2G聚合酶作为合适的酶用于链延伸的用途。
[0011]本专利技术人所开发方法的效率高，不仅使修饰的寡核苷酸的捕获和基于PCR的检测成为可能，而且首次实现了对修饰的寡核苷酸样本的大规模平行测序，这是一项革命性的技术，为寡核苷酸治疗剂发现、制造、质量保证、治疗性开发和患者监测提供了关键的新工具。
[0012]专利技术概述
[0013]本专利技术提供用于对修饰的寡核苷酸(诸如2'糖修饰的寡核苷酸，诸如LNA寡核苷酸或2-O-甲氧基乙基寡核苷酸)进行测序的方法，所述方法包括以下顺序步骤：
[0014](I)对包含修饰的寡核苷酸的寡核苷酸模板进行聚合酶介导的第一链合成，以产生包含修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；
[0015](II)对步骤(I)的第一链合成产物进行基于引物的测序。
[0016]本专利技术提供对修饰的寡核苷酸群体(诸如2'糖修饰的寡核苷酸，诸如LNA寡核苷酸群体或2-O-甲氧基乙基寡核苷酸群体)进行平行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0017](I)对寡核苷酸模板的群体进行聚合酶介导的第一链合成，其中群体的每个成员是或包含修饰的寡核苷酸，以产生核酸序列的文库，每个核酸序列包含存在于寡核苷酸群体中的修饰的寡核苷酸的互补序列；
[0018](II)对步骤(I)的第一链合成产物的群体进行基于引物的测序。
[0019]在步骤(I)之后和步骤(II)之前，可以执行PCR扩增步骤：在一些实施方案中，基于引物的测序步骤可包括在步骤(II)之前或作为步骤(II)一部分的第一链合成产物的克隆扩增。在一些实施方案中，克隆扩增采用固相扩增或乳液相扩增。
[0020]本专利技术提供了一种用于对修饰的寡核苷酸的核碱基序列进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0021]a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸的3'末端；
[0022]b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生包含所述修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；
[0023]c.对步骤b)中获得的第一链合成产物进行基于引物的测序。
[0024]本专利技术提供了一种用于对修饰的寡核苷酸群体的碱基序列进行平行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0025]a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的3'末端；
[0026]b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生核酸序列群体，每个核酸序列都包含所述修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的碱基序列的互补序列；
[0027]c.对步骤b)中获得的第一链合成产物的群体进行基于引物的平行测序。
[0028]本专利技术提供一种对修饰的寡核苷酸(诸如2'糖修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸)的核碱基序列进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0029]a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸的3'末端；
[0030]b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生包含所述修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；
[0031]c.将衔接子探针连接至步骤b中获得的所述第一链合成产物的3'端；以及随后
[0032]-对步骤c)中获得的所述连接产物进行基于引物的测序；或者
[0033]-对步骤c)中获得的所述连接产物进行PCR扩增并且对PCR扩增产物进行基于引物的测序。
[0034]本专利技术提供一种方法，用于对修饰的寡核苷酸群体(诸如2'糖修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸群体)的核碱基序列进行平行测序，所述方法包括以下步骤：
[0035]a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的3'末端；
[0036]b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生核酸序列群体，每个核酸序列都包含所述修饰的寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对修饰的寡核苷酸的核碱基序列测序的方法，所述方法包括步骤：a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸的3
’
末端；b.从捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生包含修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；c.对在步骤b)中获得的第一链合成产物进行基于引物的测序。2.一种用于对修饰的寡核苷酸群体的碱基序列进行平行测序的方法，所述方法包括以下步骤：a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的3'末端；b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生核酸序列群体，每个核酸序列都包含所述修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的碱基序列的互补序列；c.对步骤b)中获得的第一链合成产物的群体进行基于引物的平行测序。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述捕获探针包含第一引物结合位点，并且在第一链合成之前，将第一引物与所述捕获探针杂交以引发第一链合成。4.根据权利要求1或2的方法，其中所述捕获探针是自引发捕获探针。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤b之后且在步骤c之前，将所述第一链合成产物进行PCR扩增。6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤c)包括在进行基于引物的测序之前，对步骤b.的所述第一链合成产物或权利要求5的所述PCR扩增产物进行克隆扩增。7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中在将所述3'捕获探针连接到所述修饰的寡核苷酸之后，并且在第一链合成之前，对所述连接产物进行纯化，例如通过凝胶纯化或通过对所述未连接的3'捕获探针进行酶促降解。8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中使用PCR引物对进行PCR步骤，其中一个PCR引物对3'捕获探针是特异的，而第二PCR引物对修饰的寡核苷酸诸如修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述基于引物的测序步骤包括使用克隆扩增引物对所述第一链合成步骤(b)进行克隆扩增，其中一个克隆扩增引物对所述3'捕获探针是特异的，而第二克隆扩增引物对所述修饰的寡核苷酸诸如所述修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。10.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述第一链合成步骤(b)或权利要求7的所述纯化步骤之后，将衔接子探针连接在所述第一链合成产物的3'端。11.根据权利要求10的方法，其中使用一对PCR引物进行PCR步骤，其中一个PCR引物对3'捕获探针是特异的，而另一PCR引物对衔接子探针是特异的。12.根据权利要求10或11的方法，其中所述捕获探针和所述衔接子探针包含克隆扩增引物结合位点，并且所述测序步骤包括对权利要求10的所述第一链合成/衔接子探针连接产物或权利要求11的所述PCR扩增产物进行克隆扩增。13.根据权利要求12的方法，其中所述克隆扩增引物对所述第一和第二PCR引物是特异的；或所述克隆扩增引物对所述3'捕获探针和衔接子探针是特异的；或分别地一个克隆扩增引物对所述PCR引物之一是特异的，而另一个克隆扩增引物对所述3'捕获探针或所述衔
接子探针是特异的。14.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述第一链合成步骤(b)之后，将所述第一链合成产物在3'端聚核苷酸(polyN)，例如聚腺苷酸化。15.根据权利要求14的方法，其中使用具有互补poly(N)序列的引物例如多聚T引物合成第二链。16.根据权利要求15的方法，其中所述第二链合成引物进一步包含PCR引物结合位点和/或克隆扩增引物结合位点(或流动池引物结合位点)。17.根据权利要求14-16中任一项的方法，其中使用对所述3'捕获探针特异的引物以及所述第二链合成引物或对所述第二链合成引物特异的PCR引物进行所述PCR步骤。18.根据权利要求14-17中任一项的方法，其中所述测序步骤包括克隆扩增，其中一个克隆扩增引物对所述3'捕获探针是特异的，而第二克隆扩增引物对所述第二链合成引物是特异的。19.根据权利要求18的方法，其中所述PCR引物进一步包含克隆扩增引物结合位点诸如流动池捕获探针结合位点，其中所述测序步骤包括使用克隆扩增引物诸如流动池结合引物进行克隆扩增，所述克隆扩增引物与克隆扩增引物结合位点互补。20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述基于引物的测序步骤使用边合成边测序方法进行。21.根据权利要求1-20中任一项的方法，其中所述基于引物的测序方法是循环可逆终止方法(CRT)。22.根据权利要求1-21中任一项的方法，其中所述测序步骤包括克隆扩增，并且所述克隆扩增引物结合至固相支持物例如流通池，或在乳化小滴内区室化。23.根据权利要求22的方法，其中所述基于引物的测序步骤的所述克隆扩增步骤包括a.固相扩增，例如固相桥式扩增，或b.乳液相扩增，例如小滴PCR。24.根据权利要求1-23中任一项的方法，其中所述基于引物的测序使用平行测序例如大规模平行测序来进行。25.根据权利要求1-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：罗氏创新中心哥本哈根有限公司，
类型：发明
国别省市：