一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术建立了一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法。所述试剂盒含有SEQ ID No:1

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及分子生物检测领域，尤其涉及一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]由于气候变暖、水体富营养化等原因，导致内陆水体蓝藻水华发生频率和强度增加，特别是湖库型饮用水源地容易发生蓝藻水华、甚至产生藻类毒素，不仅增加水处理成本、而且对人类健康造成巨大威胁。内陆水体中水华蓝藻种类很多，其中拉氏尖头藻(Raphidiopsis raciborskii)，之前称为拉氏拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，是近年来在我国东南地区发现的一种新型的水华蓝藻，由于其具有较强的入侵性和高度适应性，其全球分布从最初的热带地区逐渐扩散到亚热带和温带地区。近几十年来，在温带和亚热带地区拉氏尖头藻水华事件的发生频率逐渐增加，其水华发生规律显著不同于微囊藻。值得注意的是，全球范围来看澳大利亚、东南亚地区的拉氏尖头藻存在产毒株系，其毒素是由产毒基因表达产生的拟柱胞藻毒素(cylindrospermopsins，CYNs)。拟柱胞藻毒素为肝毒素生物碱，具有水溶性和高稳定性，半衰期较长。在摄入到体内之后，通过不可逆抑制磷酸蛋白酶导致细胞死亡，进而对肝脏造成损害。除此之外，拟柱胞藻毒素还可以促进肿瘤发生、诱发染色体变异和胎儿畸变等。近十多年来，在我国东南地区许多水库型水源地发现拉氏尖头藻水华现象，水华形成之前的早期检测与早期诊断对蓝藻水华防控十分关键。然而，经典的显微镜方法费时费力、而且难于区分产毒株系和非产毒株系，普通的荧光定量PCR方法难于对低丰度蓝藻进行有效监测。因此，亟需研发快速、灵敏、准确和高效的技术方法对水体中拉氏尖头藻丰度及其产毒潜力进行监测和评估。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种使用数字PCR(dPCR)方法同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻与产拟柱胞藻毒素特异基因的方法，应用dPCR方法的灵敏度高、准确性高的优势，利用特异性引物精确地对拉氏尖头藻丰度及其产毒能力进行测定和评估，实现拉氏尖头藻低丰度时期成功检出，以达到早期检测和早期预警的效果。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术提供一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒，其特征在于，含有SEQ ID No:1-4所示序列；其中SEQ ID No:1-2为检测拉氏尖头藻特异基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3-4为检测产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的上下游引物。
[0005]进一步，还含有rpoC1基因荧光标记TaqMan探针(VIC)和cyrJ基因荧光标记TaqMan探针(FAM)，其中rpoC1基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:5，cyrJ基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:6。
[0006]本专利技术还提供一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的
检测方法，其特征在于，使用了所述试剂盒。
[0007]进一步，步骤为，将待测样本的DNA于暗光条件下加入到反应体系中，进行双模块dPCR扩增，读取数据结果，根据数据结果的平均值分别计算拉氏尖头藻特异基因rpoC1和产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的拷贝数。
[0008]进一步，待测样本的DNA浓度为每个反应1-104个拷贝。
[0009]进一步，所述反应体系为，14.5μL的反应体积，包括1
×
dPCR缓冲液7.25μL、SEQ ID No:1-4所示序列各900nM、VIC探针和FAM探针各200nM、待测DNA样本和ddH2O。
[0010]进一步，所述dPCR扩增的条件为，预变性94-96℃、5-10min；再按照以下设定条件PCR扩增循环36-39次：94-96℃、30s，56-58℃、2min；96-98℃、2min，最后10℃保温。
[0011]进一步，所述待测样本包括产毒拉氏尖头藻，也适用于其他水华蓝藻物种。
[0012]与现有水华蓝藻密度测定方法相比，本方法有以下优点：
[0013](1)本专利技术所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法结果计算不依赖于标准曲线，可同时实现蓝藻丰度及其产毒基因的绝对定量。
[0014](2)本专利技术所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法灵敏度较高，比显微镜方法和荧光定量PCR的检测限低3个数量级，最低可检测到每升水单拷贝，能够达到产毒蓝藻早期检测和早期预警的效果。
[0015](3)本专利技术所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法相比于传统的显微镜方法和荧光定量PCR操作简单，受环境抑制影响较小，结果重复性更好，应用价值较高。
[0016](4)本专利技术所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法所用样本量较少，可节省环境样本量。
附图说明
[0017]图1为dPCR方法测定拉氏尖头藻特异性基因rpoC1和产拟柱胞藻毒素基因cyrJ时，DNA浓度较为合适时的荧光分布图；
[0018]图2为dPCR方法测定拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ两种基因时，DNA浓度过高时的荧光分布图；
[0019]图3为dPCR方法测定拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ两种基因时，dPCR结果出现单拷贝时的荧光分布图；
[0020]图4为dPCR检测范围内预期拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因预期拷贝值与实际测定拷贝数值关系曲线；
[0021]图5为建立本专利技术最优检测浓度范围的技术路线图；
[0022]图6为本专利技术用于水华蓝藻监测的路线图。
具体实施方式
[0023]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明
书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
[0024]实施例1：dPCR技术对拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因的最优检测浓度范围确定
[0025]1.获得已知拷贝数的rpoC1和cyrJ基因模板质粒DNA样本：
[0026]1)使用cyl2/cyl4和cyrJF/cyrJR两对引物对含有rpoC1和cyrJ的水环境DNA样本进行dPCR扩增，获得扩增产物；
[0027]cyl2：5
’-
GGCATTCCTAGTTATATTGCCATACTA-3
’
；SEQ ID No:1；
[0028]cyl4：5
’-
GCCCGTTTTTGTCCCTTTGCTGC-3
’...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒，其特征在于，含有SEQ ID No:1-4所示序列；其中SEQ ID No:1-2为检测拉氏尖头藻特异基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3-4为检测产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的上下游引物。2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还含有rpoC1基因荧光标记TaqMan探针和cyrJ基因荧光标记TaqMan探针，其中rpoC1基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:5，cyrJ基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:6。3.一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的检测方法，其特征在于，使用了权利要求1和2的试剂盒。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤为，将待测样本的DNA于暗光条件下加入到反应体系中，进行数字PCR扩增，读取荧光信号，根据荧光信号的平均值分别计算拉氏尖头藻特异基因rpoC1和...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，谭凤娇，肖鹏，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：