一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种检测大鼠外周血HDAC5基因表达的试剂盒及其使用方法，通过该试剂盒，筛选孕期感染青春期子代外周血单核细胞HDAC5表达量明显上调的大鼠继续饲养至成年期进行行为检测(开放旷场实验、Y迷宫实验以及前脉冲抑制效率(PPI))，结果显示，HDAC5显著升高的大鼠其成年期行为也显著异常，如焦虑水平增加、记忆缺陷及感觉门控功能障碍等，据此推断本试剂盒可以有效评估孕期感染青春期子代的模型质量，并用以后续研究。并用以后续研究。并用以后续研究。

【技术实现步骤摘要】
一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于外周血检测
，具体涉及一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]通过制备孕期感染子代大鼠模型，检测青春期(出生后35天)及成年期(出生后56天)海马、前额叶皮质及外周单核细胞中HDAC5的表达水平，并结合行为学分析，发现外周血单核细胞中HDAC5升高早于异常行为出现，故而，可将HDAC5作为评估孕期感染子代大鼠模型质量的早期外周标记分子。但在检测HDAC5表达水平时操作较为繁琐，因此，急需一种可检测大鼠外周血单核细胞HDAC5表达水平的试剂盒。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒及其使用方法，具体方案如下：
[0004]一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒，该试剂盒所包含的试剂及使用说明如下表所示：
[0005][0006]表中：引物Ⅰ：GTCGAAAGGATGGCACTGTT(HDAC5上游)
[0007]引物Ⅱ：AGCCAGTAAAGCCGTTCTCA(HDAC5下游)
[0008]引物Ⅲ：GGAGCGAGATCCCGTCAAGA(GAPDH上游)
[0009]引物Ⅳ：CACAAACATGGGGGCATCAG(GAPDH下游)。
[0010]一种基于上述试剂盒的使用方法，其包括如下操作流程：
[0011]第一步：外周血单核细胞的分离
[0012]取肝素抗凝血5mL，沿管壁徐徐滴流叠加在盛有5mL溶液a的试管内，应注意保持两者界面清晰，在室温下以2000r/min的速度离心20min，用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单核
细胞；
[0013]第二步：单核细胞RNA的抽提
[0014]步骤(1)：收集到的单核细胞加入1000μL的溶液b，室温放置5min；
[0015]步骤(2)：加入200μL的溶液c，涡旋混匀15sec；
[0016]步骤(3)：室温放置10min后，在4℃的环境下，12000g离心15min；
[0017]步骤(4)：取上清，加入等体积的溶液d，颠倒混匀10余次；
[0018]步骤(5)：室温静置10min，在4℃的环境下，在4℃的环境下，12000g离心15min；
[0019]步骤(6)：弃上清，加入1mL 75％溶液e(溶液e使用溶液f稀释配置)，洗涤沉淀RNA；
[0020]步骤(7)：4℃，7500g离心5min，重复步骤(6)-步骤(7)；
[0021]步骤(8)：弃上清，于超净工作台中干燥5min；
[0022]步骤(9)：加入适量溶液f(20～50μL)溶解RNA，置于55℃水浴10min，转弹管壁，离心；
[0023]步骤(10)：用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，确保OD260/280比值在1.8-2.0之间；
[0024]步骤(11)：根据测定浓度稀释，用溶液f稀释2μg RNA至20μL体系即为上样模板；
[0025]第三步：实时定量PCR检测HDAC5与内参基因GAPDH
[0026]步骤(1)：制备反应体系
[0027]采用20μL反应体系，每个样品设置3个复孔，以保证结果的可靠性。(HDAC5检测加入引物引物Ⅰ和引物Ⅱ；GAPDH内参检测加入引物Ⅲ和引物Ⅳ)
[0028]组分每孔加入量溶液g10μL正向引物(10μM)0.5μL反向引物(10μM)0.5μL溶液h0.2μL溶液f6.8μLRNA模板2μL总体积20μL
[0029]操作时，保证所有试剂都在冰上操作，按照上述反应体系用移液枪将PCR反应液加入到PCR管中，封盖后，瞬时离心，放入荧光定量PCR仪中进行扩增；
[0030]步骤(2)：PCR扩增
[0031]程序设定如下(步骤3至步骤5持续40个循环)：
[0032][0033]步骤(3)：数据分析
[0034]测得样品HDAC5与内参基因GAPDH扩增的CT值，并采用2-ΔΔCT法，计算HDAC5的相对含量。
[0035]本专利技术相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地说，本专利技术具有以下优点：
[0036]通过该试剂盒，筛选孕期感染青春期子代外周血单核细胞HDAC5表达量明显上调的大鼠继续饲养至成年期进行行为检测(开放旷场实验、Y迷宫实验以及前脉冲抑制效率(PPI))，结果显示，HDAC5显著升高的大鼠其成年期行为也显著异常，如焦虑水平增加、记忆缺陷及感觉门控功能障碍等，据此推断本试剂盒可以有效评估孕期感染青春期子代的模型质量，并用以后续研究。
附图说明
[0037]图1是本专利技术中孕期感染青春期子代HDAC5高表达与对照组大鼠在成年期进行行为检测对比图。
具体实施方式
[0038]下面通过具体实施方式，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
[0039]实施例
[0040]一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒，该试剂盒所包含的试剂及使用说明如下表所示：
[0041][0042]表中：引物Ⅰ：GTCGAAAGGATGGCACTGTT(HDAC5上游)
[0043]引物Ⅱ：AGCCAGTAAAGCCGTTCTCA(HDAC5下游)
[0044]引物Ⅲ：GGAGCGAGATCCCGTCAAGA(GAPDH上游)
[0045]引物Ⅳ：CACAAACATGGGGGCATCAG(GAPDH下游)。
[0046]一种基于上述试剂盒的使用方法，其包括如下操作流程：
[0047]第一步：外周血单核细胞的分离
[0048]取肝素抗凝血5mL，沿管壁徐徐滴流叠加在盛有5mL溶液a的试管内，应注意保持两者界面清晰，在室温下以2000r/min的速度离心20min，用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单核
细胞；
[0049]第二步：单核细胞RNA的抽提
[0050]步骤(1)：收集到的单核细胞加入1000μL的溶液b，室温放置5min；
[0051]步骤(2)：加入200μL的溶液c，涡旋混匀15sec；
[0052]步骤(3)：室温放置10min后，在4℃的环境下，12000g离心15min；
[0053]步骤(4)：取上清，加入等体积的溶液d，颠倒混匀10余次；
[0054]步骤(5)：室温静置10min，在4℃的环境下，在4℃的环境下，12000g离心15min；
[0055]步骤(6)：弃上清，加入1mL 75％溶液e(溶液e使用溶液f稀释配置)，洗涤沉淀RNA；
[0056]步骤(7)：4℃，7500g离心5min，重复步骤(6)-步骤(7)；
[0057]步骤(8)：弃上清，于超净工作台中干燥5min；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测大鼠外周血HDAC5表达水平的试剂盒，其特征在于：该试剂盒所包含的试剂及使用说明如下表所示：表中：引物Ⅰ：GTCGAAAGGATGGCACTGTT(HDAC5上游)引物Ⅱ：AGCCAGTAAAGCCGTTCTCA(HDAC5下游)引物Ⅲ：GGAGCGAGATCCCGTCAAGA(GAPDH上游)引物Ⅳ：CACAAACATGGGGGCATCAG(GAPDH下游)。2.根据权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下操作流程：第一步：外周血单核细胞的分离
取肝素抗凝血5mL，沿管壁徐徐滴流叠加在盛有5mL溶液a的试管内，应注意保持两者界面清晰，在室温下以2000r/min的速度离心20min，用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单核细胞；第二步：单核细胞RNA的抽提步骤(1)：收集到的单核细胞加入1000μL的溶液b，室温放置5min；步骤(2)：加入200μL的溶液c，涡旋混匀15sec；步骤(3)：室温放置10min后，在4℃的环境下，12000g离心15min；步骤(4)：取上清，加入等体积的溶液d，颠倒混匀10余次；步骤(5)：室温静置10min，在4℃的环境下，在4℃的环境下，12000g离心15min；步骤(6)：弃上清，加入1mL 75％溶液e(溶液e使用溶液f稀释配置)，洗涤沉淀RNA；步骤(7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文强，苏玺，宋盟，邵明龙，刘青，张露文，吕路线，
申请(专利权)人：河南省精神病医院新乡医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：