本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其是指一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，包括如下步骤：S1，cfDNA的提取：提取待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；S2，制备数字PCR反应混合液：将待测样本cfDNA模板、EGFR基因扩增区域正向和反向扩增引物、EGFR基因扩增区域TaqMan探针、内参基因EFTUD2正向和反向扩增引物、内参基因EFTUD2标记TaqMan探针以及ddPCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液，所述cfDNA模板的含量为0.5～2ng/μL；S3，将步骤S2中得到的PCR反应混合液加载到数字PCR芯片中，进行ddPCR扩增反应；S4，PCR芯片荧光信号读取；S5，数据分析和结果统计。本发明专利技术灵敏度高，操作简单，无需采集组织标本，有效减少了病人的痛苦，特别适合对组织取样不耐受的患者。的患者。的患者。
【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其是指一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法。
技术介绍
[0002]人表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是具有酪氨酸激酶活性的跨细胞膜糖蛋白受体，控制细胞内信号转导，在细胞生长、分化、增殖、黏附、凋亡或在血管生成中起重要作用。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR靶向治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。目前临床使用的抗EGFR药物包括EGFR激酶小分子抑制剂(吉菲替尼/易瑞沙，厄洛替尼/特罗凯)，单克隆抗体(维克替比/帕尼单抗，爱必妥/西妥昔单抗，泰欣生/尼妥珠单抗)和受体酪氨酸激酶小分子抑制剂(拉帕替尼)。
[0003]大量临床研究表明，EGFR基因扩增可以预测结直肠癌、非小细胞肺癌以及其他癌肿对易瑞沙(吉非替尼)、特罗凯(厄罗替尼)等酪氨酸激酶抑制剂的治疗敏感性。大约1/3的非小细胞肺癌患者，EGFR基因扩增检测结果为阳性，而在阳性组患者中，应用易瑞沙(吉非替尼)、特罗凯(厄罗替尼)的有效率为35％，疾病控制率高达70％。检测结直肠癌、非小细胞肺癌患者EGFR基因，有助于筛选出易瑞沙、特罗凯等抗EGFR药物的敏感人群，有利于指导临床用药。
[0004]目前检测EGFR基因扩增最常用的方法是荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)，其基本原理是通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体和基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。FISH技术检测EGFR扩增特异性高，但样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，且无法高通量的检测，结果判读主观性和专业性较强。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，灵敏度高，操作简单，无需采集组织标本，有效减少了病人的痛苦，特别适合对组织取样不耐受的患者。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，包括如下步骤：
[0008]S1，cfDNA的提取：提取待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；
[0009]S2，制备数字PCR反应混合液：将待测样本cfDNA模板、EGFR基因扩增区域正向和反向扩增引物、EGFR基因扩增区域TaqMan探针、内参基因EFTUD2正向和反向扩增引物、内参基因EFTUD2标记TaqMan探针以及ddPCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液，所述cfDNA模板的含量为0.5～2ng/μL；
[0010]S3，将步骤S2中得到的PCR反应混合液加载到数字PCR芯片中，进行ddPCR扩增反
应；
[0011]S4，PCR芯片荧光信号读取；
[0012]S5，数据分析和结果统计。
[0013]优选地，步骤S2中所述cfDNA模板的更优选含量为0.8～1.2ng/μL。
[0014]优选地，步骤S2中的所述EGFR基因扩增区域正向和反向扩增引物包括用于扩增EGFR基因扩增区域的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID NO:1和一条反向引物SEQ ID NO:2，所述正向引物SEQ ID NO:1的序列为：5'-ACCTTTGCAGAGAGGCTTAAT-3'，所述反向引物SEQ ID NO:2的序列为：5'-CCTAGGCCCAAAGGAATGATAG-3'。
[0015]优选地，步骤S2中的所述EGFR基因扩增区域标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交EGFR基因扩增区域的探针SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3的序列为5'-TGCTCTTAAAGGGATATCCTCTCCTGGT-3'。
[0016]优选地，所述EGFR基因扩增区域的探针SEQ ID NO:3在5'端标记的荧光基团为FAM，在3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
[0017]优选地，步骤S2中的所述内参基因EFTUD2正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID NO:4和一条反向引物SEQ ID NO:5，正向引物SEQ ID NO:4的序列为5'-GGTCTTGCCAGACACCAAAG-3'，反向引物SEQ ID NO:5的序列为5'-TGAGAGGACACACGCAAAAC-3'。
[0018]优选地，步骤S2中的内参基因EFTUD2标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因EFTUD2扩增区域的探针SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:6的序列为5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'。
[0019]优选地，所述内参基因EFTUD2扩增区域的探针SEQ ID NO:6在5'端标记的荧光基团为VIC，在3'端标记的荧光淬灭基团为QSY。
[0020]优选地，步骤S3中的ddPCR扩增程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，57℃退火/延伸1分钟，共进行45个循环，10℃保持。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]1)本专利技术所述的一种基于数字PCR平台EGFR基因扩增的检测方法在检测灵敏度方面较传统方法有显著的提高，其最低检测比例可达到0.01％；
[0023]2)本专利技术所述的基于数字PCR平台EGFR基因扩增的检测方法不需要采集组织标本，仅使用外周血即可完成检测，减少了病人的痛苦，特别适合对组织取样不耐受的患者；
[0024]3)本专利技术所述的基于数字PCR平台EGFR基因扩增的检测方法操作简便，大大减少了临床检测成本及工作量，具有较高的应用价值。。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的样本1-1的ddPCR具体扩增结果；
[0026]图2为本专利技术的样本1-2的ddPCR具体扩增结果。
具体实施方式
[0027]为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本专利技术作进一步的说
明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。
[0028]实施例1
[0029]1、cfDNA的提取：
[0030]采用试剂盒提取全血样本中的cfDNA，提取步骤如下：
[0031]1)在50ml离心管中先加入300μL QIAGEN蛋白酶K，再加入3mL血浆和2.4mL Buffer ACL，盖上盖子，涡旋30s。
[0032]2)60℃孵育30min；之后取出，加入5.4mLBuffer ACB，盖上盖子涡旋15-30s，混合液冰上孵育5min。
[0033]3)然后进行真空泵抽提。具体的操作参见QIAGEN公司的QIA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：S1，cfDNA的提取：提取待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；S2，制备数字PCR反应混合液：将待测样本cfDNA模板、EGFR基因扩增区域正向和反向扩增引物、EGFR基因扩增区域TaqMan探针、内参基因EFTUD2正向和反向扩增引物、内参基因EFTUD2标记TaqMan探针以及ddPCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液，所述cfDNA模板的含量为0.5～2ng/μL；S3，将步骤S2中得到的PCR反应混合液加载到数字PCR芯片中，进行ddPCR扩增反应；S4，PCR芯片荧光信号读取；S5，数据分析和结果统计。2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，其特征在于：步骤S2中所述cfDNA模板的更优选含量为0.8～1.2ng/μL。3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，其特征在于：步骤S2中的所述EGFR基因扩增区域正向和反向扩增引物包括用于扩增EGFR基因扩增区域的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQ ID NO:1和一条反向引物SEQ ID NO:2，所述正向引物SEQ ID NO:1的序列为：5'-ACCTTTGCAGAGAGGCTTAAT-3'，所述反向引物SEQ ID NO:2的序列为：5'-CCTAGGCCCAAAGGAATGATAG-3'。4.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的EGFR基因扩增的检测方法，其特征在于：步骤S2中的所述EGFR基因扩增区域标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交EGFR基因扩增区域的探针SEQ ID NO:3，SEQ ID N...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨春燕，段小红，杨文娟，丁蕊，张腾龙，周启明，
申请(专利权)人：南京求臻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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