一种确定文库扩增循环数的方法技术

一种确定文库扩增循环数的方法，包括：在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量PCR检测，获得待测样本的实时荧光定量PCR检测CT值，根据所述CT值确定后续文库扩增所需的循环数。通过在文库扩增前对待测样本进行实时荧光定量PCR，获得实时荧光定量PCR检测CT值，依据该CT值确定后续文库扩增的循环数，有效避免循环数不足导致文库无法上机，或者循环数偏高导致的基因漏检，为后续的上机测序提供定量参考数据。参考数据。参考数据。

【技术实现步骤摘要】
一种确定文库扩增循环数的方法


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种确定文库扩增循环数的方法。

技术介绍

[0002]近年来，由于二代高通量测序的飞速发展，测序费用大幅下降，越来越多的研究人员借助此技术对基因组、转录组、蛋白质组进行深入分析。高通量RNA测序(RNA sequencing，RNA-seq)，即是用高通量测序技术，对mRNA、LncRNA、miRNA等RNA进行测序分析。RNA-seq能够从整体水平研究基因功能和结构，解释特定生物学过程及疾病发生过程中的分子机制。
[0003]利用高通量测序技术对组织或细胞中RNA反转录而成的cDNA文库进行测序，通过生物信息学分析可计算不同RNA的表达量、发现新的转录本、进行转录本定位、分析可变剪切、检测融合基因等
[0004]福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织是应用最广泛的临床标本之一，它们为RNA-seq提供了大量的资源，将大大增强基于人群的癌症研究。为更深入的研究肿瘤生物标志物提供了重要的机会，目前收到的样本其来源及保存条件难以控制，导致获得的RNA质量参差不齐，以mRNA建库为例，在rRNA去除、mRNA逆转录后无法确定真实的可扩增模板数，无法确定合适的PCR循环数(cycle)。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种评估扩增产物循环数的方法。
[0006]根据第一方面，一种实施例中提供一种确定文库扩增循环数的方法，包括：在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量PCR检测，获得待测样本的实时荧光定量PCR检测CT值，根据所述CT值确定后续文库扩增所需的循环数。
[0007]根据第二方面，一种实施例中提供一种建库方法，包括对RNA样本进行前处理，得到待测样本，然后采用第一方面所述方法进行实时荧光定量PCR检测，获得实时荧光定量PCR检测CT值，根据所述CT值确定后续文库扩增所需的循环数，再按照所述循环数进行文库扩增，得到可用于上机测序的文库。
[0008]依据上述实施例的确定文库扩增循环数的方法，通过在文库扩增前对待测样本进行实时荧光定量PCR，获得实时荧光定量PCR检测CT值，依据该CT值确定后续文库扩增的循环数，有效避免循环数不足导致文库无法上机，或者循环数偏高导致的基因漏检，为后续的上机测序提供定量参考数据。
附图说明
[0009]图1显示为实施例1的qPCR反应程序设置示意图。
具体实施方式
[0010]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0011]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0012]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0013]现有技术中，RNA样本经过逆转录、二链合成等步骤后无法评估具体剩余量，造成后续文库扩增时，无法确定合适的PCR循环数(cycle)。在建库的PCR扩增步骤中，若循环数偏低，文库产量不足，则不满足高通量测序的上机要求；若循环数偏高，文库产量过多，但杂交或上机时只能取其中一部分，容易导致漏检。医疗样本通常总量都很有限，每个样本都因其不可替代性而十分珍贵，没有再重做的机会。
[0014]对于不同质量不同建库起始量的RNA样本，为了控制可上机的文库总量，避免产量过低无法上机或产量过高导致漏检，因此在扩增时需严格控制循环数。为了解决这一问题，在一些实施例中，本专利技术在文库扩增前增加荧光定量PCR步骤，根据CT值指导PCR扩增的循环数，以便精准控制文库产量。
[0015]本文中，“cycle数”也可称为“循环数”。
[0016]本文中，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，简称qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。
[0017]本文中，CT值：C代表Cycle，即循环数，T代表荧光阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，即从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。荧光域值控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉点确定CT值。
[0018]荧光域值(threshold)：PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
[0019]本文中，FFPE样本(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，简称FFPE)是指使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本。
[0020]根据第一方面，在一些实施例中，一种确定文库扩增循环数的方法，包括：
[0021]在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量PCR检测，获得待测样本的实时荧光定量PCR检测CT值，根据所述CT值确定后续文库扩增所需的循环数。
[0022]在一些实施例中，所述文库扩增的循环数＝M+N，所述M为CT值的小数点后第一位
四舍五入后的整数，所述N为-4～7。N的取值可以为-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7等等。
[0023]在一些实施例中，所述N为0～7。
[0024]在一些实施例中，所述N为1～7。
[0025]在一些实施例中，如果文库扩增后，上机测序之前，不再对待测样本进行杂交捕获，则N为0～2。
[0026]在一些实施例中，如果文库扩增后，上机测序之前，需要对待测样本进行杂交捕获，则N为3～7。
[0027]在一些实施例中，所述待测样本为RNA样本经过逆转录得到的cDNA。待测样本也可以为DNA样本，但鉴于RNA在经过逆转录、二链合成等步骤后无法评估具体剩余量，所以需要qPCR定量，因此，待测样本通常为经过RNA样本逆转录得到的cDNA。
[0028]在一些实施例中，所述cDNA为双链。
[0029]在一些实施例中，所述cDNA为连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种确定文库扩增循环数的方法，其特征在于，包括：在文库扩增之前，预先对待测样本进行实时荧光定量PCR检测，获得待测样本的实时荧光定量PCR检测CT值，根据所述CT值确定后续文库扩增所需的循环数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述文库扩增的循环数＝M+N，所述M为CT值的小数点后第一位四舍五入后的整数，所述N为-4～7，优选为0～7，更优选为1～7；任选地，如果文库扩增后，上机测序之前，不再对待测样本进行杂交捕获，则N为0～2；任选地，如果文库扩增后，上机测序之前，需要对待测样本进行杂交捕获，则N为3～7。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为RNA样本经过逆转录得到的cDNA。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cDNA为双链；任选地，所述cDNA为连接有接头的cDNA。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系中含有DNA聚合酶、镁离子、dNTP、荧光染料、热启动试剂、PCR增强剂、PCR稳定剂中的至少一种；任选地，所述DNA聚合酶选自热启动DNA聚合酶，优选为Taq DNA聚合酶；任选地，所述荧光染料选自SYBR green I、EvaGreen、Lc Green、SYTO、BEBO、BETO、BETIBO、BOXTO中的至少一种；任选地，所述实时荧光定量PCR反应体系中还含有引物；任选地，实时荧光定量PCR反应条件依次如下：90-98℃，30s-10min；然后进入30-40个循环，每个循环如下：90-98℃，15-60s，55-65℃，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：楚玉星，杨玲，王一茜，王珺，洪立梅，吴善旋，李奇，
申请(专利权)人：深圳基因家科技有限公司，
类型：发明
国别省市：