一种用于肺癌早期筛查的组合物及试剂盒、以及肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于肺癌早期筛查的组合物及试剂盒、以及肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法，所述用于肺癌早期筛查的组合物包括第一特异性引物和探针、第二特异性引物和探针、第三特异性引物和探针、第四特异性引物和探针、第五特异性引物和探针、第六特异性引物和探针、第七特异性引物和探针、第八特异性引物和探针以及内参引物和探针。本发明专利技术提供的用于肺癌早期筛查的组合物可以通过评估ctDNA甲基化变异情况，实现肺癌的早期筛查，且具有敏感度高、特异性强的特点。特异性强的特点。特异性强的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺癌早期筛查的组合物及试剂盒、以及肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种用于肺癌早期筛查的组合物及试剂盒、以及肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法。

技术介绍

[0002]肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。原发性支气管肺癌(简称肺癌)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国卫生部2008年4月公布的《第三次全国居民死亡原因调查》显示，在过去的30年中，我国肺癌发病率增量较大，已取代肺癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。
[0003]近年来，虽然医学技术不断发展，但肺癌患者的5年生存率并未得到明显改善，生存率仅提高到10～15％，肺癌生存率低的一个重要原因是个体健康意识不足，对自身出现的异常现象不够重视，未及时就医，导致肺癌延迟诊断。因此，加强卫生知识宣传，大力推行个体对自身肺癌危险因素的筛查，对降低肺癌发病率、提高早期诊断率、改善患者预后有极为重要的意义。由于肺癌早期常缺乏特异性表现，甚至部分患者以非呼吸道症状起病，造成漏诊和误诊。因此，大部分患者就诊时已属于晚期。因此，早期诊断和早期治疗对改善肺癌患者的预后及降低死亡率有重要意义。
[0004]目前肺癌的检测主要通过影像学、组织活检及癌胚抗原(CEA)等。然而，影像学易受操作者经验影响，并且依赖设备，费用昂贵，尤其是在医疗资源有限的情况下，其准确率难以保证，难以广泛和常规应用。组织活检是目前临床上确诊肺癌的金标准，但组织活检存在较大局限性，例如手术取样困难，或者某些癌症部位不便进行穿刺，并且穿刺本身也会带来一定的临床风险，反复穿刺筛查更会给患者带来巨大痛苦。目前应用最广的血清学检测是对癌胚抗原(CEA)的检测，但CEA对早期肺癌的灵敏度和特异性都不高。因此，寻找新的肺癌标志物，尤其是预警监测和早期诊断的标志物对提高早期肺癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肺癌病死率具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是提出一种主用于肺癌早期筛查的组合物及试剂盒、以及肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法，旨在一种可以进行肺癌早期筛查的标志物。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提出一种用于肺癌早期筛查的组合物，包括第一特异性引物和探针、第二特异性引物和探针、第三特异性引物和探针、第四特异性引物和探针、第五特异性引物和探针、第六特异性引物和探针、第七特异性引物和探针、第八特异性引物和探针以及内参引物和探针；其中，
[0007]所述第一特异性引物和探针的序列如下：
[0008]正向引物：ATTGTGTCTGCCTAGGAAAAGGGTGTG，
[0009]反向引物：AAAAGTCATTCTCGGCGGAGTGTTC，
[0010]探针：FAM
‑
CTCTCCGCAAGTGCCGCTCCT
‑
BHQ1；
[0011]所述第二特异性引物和探针的序列如下：
[0012]正向引物：TCGGCCCTGCCATGCCTCACAT，
[0013]反向引物：AGTGCCAGGGCAGGAAAGCCACAG，
[0014]探针：FAM
‑
CCCCAGGATGCCGCGGTGGGAACT
‑
BHQ1；
[0015]所述第三特异性引物和探针的序列如下：
[0016]正向引物：AGAGAATCTCACCACAAATGAAA，
[0017]反向引物：TATGCCCTGCGATAGAAACAC，
[0018]探针：FAM
‑
ACCTCTCCCCTTTCACGTAGT
‑
BHQ1；
[0019]所述第四特异性引物和探针的序列如下：
[0020]正向引物：GGCAGGAAGTGTGAGGTGTTGAGCAGCTA，
[0021]反向引物：TCCGACTTCCGCTCCTCCTCACCACAA，
[0022]探针：FAM
‑
CCTCCTGCTCCCCGCCGCCTCC
‑
BHQ1；
[0023]所述第五特异性引物和探针的序列如下：
[0024]正向引物：ACTTCTGCGAGCCCAACCC，
[0025]反向引物：ACAGCAGGTCGCAGCCGTC，
[0026]探针：FAM
‑
CTGCAACGTCAGCTCGCACGGCAT
‑
BHQ1；
[0027]所述第六特异性引物和探针的序列如下：
[0028]正向引物：TGGCATAAAGTCTACTTGAGGGA，
[0029]反向引物：CGTGCACTCTGTTTAGTGTCT，
[0030]探针：FAM
‑
CAACCCGGCACGGTTACGTT
‑
BHQ1；
[0031]所述第七特异性引物和探针的序列如下：
[0032]正向引物：TTTCTCGGTATTTCGTTGTCAAGGCCAC，
[0033]反向引物：GAGCGGCCGGGAGAAACCCA，
[0034]探针：FAM
‑
CACCCCGGGATCCGACGGCAAGG
‑
BHQ1；
[0035]所述第八特异性引物和探针的序列如下：
[0036]正向引物：AGGCGCTCCTCGCTAGGGCTG，
[0037]反向引物：ACGGCATTCCTACATGAGATGGGGGTC，
[0038]探针：FAM
‑
CCACCGCACAGGAAACGGGGCAGG
‑
BHQ1；
[0039]所述内参引物和探针的序列如下：
[0040]正向引物：GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，
[0041]反向引物：ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA，
[0042]探针：VIC
‑
TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC
‑
BHQ1。
[0043]进一步地，本专利技术还提出一种用于肺癌早期筛查的试剂盒，包括PCR反应液、甲基化敏感内切酶以及如上所述的用于肺癌早期筛查的组合物。
[0044]可选地，所述甲基化敏感内切酶包括HinP1I甲基化敏感内切酶、HpaII甲基化敏感
内切酶、AciI甲基化敏感内切酶以及HpyCH4IV甲基化敏感内切酶。
[0045]更进一步地，本专利技术还提出一种肺癌早期ctDNA甲基化的检测方法，包括以下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌早期筛查的组合物，其特征在于，包括第一特异性引物和探针、第二特异性引物和探针、第三特异性引物和探针、第四特异性引物和探针、第五特异性引物和探针、第六特异性引物和探针、第七特异性引物和探针、第八特异性引物和探针以及内参引物和探针；其中，所述第一特异性引物和探针的序列如下：正向引物：ATTGTGTCTGCCTAGGAAAAGGGTGTG，反向引物：AAAAGTCATTCTCGGCGGAGTGTTC，探针：FAM
‑
CTCTCCGCAAGTGCCGCTCCT
‑
BHQ1；所述第二特异性引物和探针的序列如下：正向引物：TCGGCCCTGCCATGCCTCACAT，反向引物：AGTGCCAGGGCAGGAAAGCCACAG，探针：FAM
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CCCCAGGATGCCGCGGTGGGAACT
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BHQ1；所述第三特异性引物和探针的序列如下：正向引物：AGAGAATCTCACCACAAATGAAA，反向引物：TATGCCCTGCGATAGAAACAC，探针：FAM
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ACCTCTCCCCTTTCACGTAGT
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BHQ1；所述第四特异性引物和探针的序列如下：正向引物：GGCAGGAAGTGTGAGGTGTTGAGCAGCTA，反向引物：TCCGACTTCCGCTCCTCCTCACCACAA，探针：FAM
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CCTCCTGCTCCCCGCCGCCTCC
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BHQ1；所述第五特异性引物和探针的序列如下：正向引物：ACTTCTGCGAGCCCAACCC，反向引物：ACAGCAGGTCGCAGCCGTC，探针：FAM
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CTGCAACGTCAGCTCGCACGGCAT
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BHQ1；所述第六特异性引物和探针的序列如下：正向引物：TGGCATAAAGTCTACTTGAGGGA，反向引物：CGTGCACTCTGTTTAGTGTCT，探针：FAM
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CAACCCGGCACGGTTACGTT
‑
BHQ1；所述第七特异性引物和探针的序列如下：正向引物：TTTCTCGGTATTTCGTTGTCAAGGCCAC，反向引物：GAGCGGCCGGGAGAAACCCA，探针：FAM
‑
CACCCCGGGATCCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：段小红，宋莹莹，张怡然，于龙飞，商宇红，顾丽清，
申请(专利权)人：南京求臻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：