本发明专利技术公开了一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，属于微生物绝对定量准确测定技术领域。本发明专利技术提供了一种测定发酵产品中的微生物生物量的方法，可以以酿酒酵母为计数基准，通过将血球计数板计数与qPCR相结合的方法，以酿酒酵母数量来衡量难以计数的霉菌的数量，即以酵母当量来表示其他微生物的数目，采用该种方法使得发酵过程的微生物能准确的测定其生物量。定其生物量。定其生物量。
【技术实现步骤摘要】
一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法
[0001]本专利技术涉及一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，属于微生物绝对定量准确测定
技术介绍
[0002]黄酒是深受人们喜爱的一种饮品，已有9000多年的历史，现代化黄酒酿造采用了含有酿酒酵母的强化酒母和黄曲霉SU16的强化熟麦曲以及生麦曲进行多菌种混合双边发酵的工艺，前期研究表明曲霉属与酿酒酵母等真菌是黄酒酿造过程中的优势功能微生物，在发酵醪中占到菌群结构50％以上。因此为了更好地分析优势功能微生物在黄酒酿造中的作用，需要快速准确地测定发酵过程中生物量的变化。
[0003]传统微生物的生物量测定方法有平板菌落计数法，紫外分光光度计法、干重法、血球板计数法、流式细胞仪法等等。酿酒酵母的生物量测定的传统方法主要是显微镜血球计数法和平板菌落计数法，前者方便操作，但后者常常需要24～48h，耗时较长；霉菌生物量测定的传统方法主要是平板菌落计数法，但是这种方法有它的局限性，在霉菌生长初期，菌丝大量生长而菌落数难以真实反映霉菌的生长。另外，霉菌涂布计数的方法需要约3-7d的长时间培养。
[0004]近年来，随着分子生物学的快速发展，宏基因组测序手段不断应用于发酵食品的菌落结构分析，但是传统的方法计数不够准确且费时费力。宏基因组测序是相对定量，不能确定微生物在发酵过程中的具体生物量。
[0005]实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。近年来，qPCR的方法逐渐应用于生物量测定中。
[0006]目前，已有学者采用微生物纯培养计数、PCR-DGGE和克隆文库分析技术等对黄酒酿造过程中的群落结构变化进行了分析研究，但是难以获得微生物的定量数据。
技术实现思路
[0007]本专利技术根据黄酒酿造过程中发酵醪液中酿酒酵母与总真菌含量变化趋势一致的现象，提供了一种以酿酒酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，该方法可更好地分析优势微生物在黄酒酿造中的作用，提出来以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，可以在同一水平上对不同微生物进行比较分析，结果更为准确，并可以对黄酒中的微生物定量。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种测定微生物数量的方法，所述黄酒微生物包括但不限于酿酒酵母、黄曲霉、米曲霉或总真菌；
[0009]所述方法包括如下步骤：
[0010](1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.3～4扩增黄曲霉基因组DNA，
以SEQ ID NO.5～6扩增总真菌基因组DNA；
[0011](2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log
10
值，X表示循环数Ct值；
[0012]酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
[0013]黄曲霉和/或：Y＝-0.3137X+10.701；
[0014]总真菌：Y＝-0.2974X+10.345。
[0015]在一种实施方式中，所述方法用于检测发酵产品中的微生物数量。
[0016]在一种实施方式中，所述方法用于检测黄酒发酵醪液中的微生物数量。
[0017]在一种实施方式中，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomyces cerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus brasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicillium chrysogenum、Monascus purpureus。
[0018]在一种实施方式中，所述方法还包括提取待测产品的基因组DNA，在将基因组DNA用于所述方法的步骤(1)的操作。
[0019]本专利技术还提供一种定量检测微生物含量的试剂盒，含有(a)～(c)至少一组引物：
[0020](a)SEQ ID NO.1～2所示扩增酿酒酵母特异性片段的引物；
[0021](b)SEQ ID NO.3～4所示扩增黄曲霉和/或米曲霉的特异性片段的引物；
[0022](c)SEQ ID NO.5～6所示的扩增总真菌的特异性片段的引物。
[0023]在一种实施方式中，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomyces cerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus brasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicillium chrysogenum、Monascus purpureus。
[0024]在一种实施方式中，所述试剂盒还含有逆转录试剂和qPCR试剂。
[0025]本专利技术还提供一种以酿酒酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，所述方法包括如下步骤：
[0026](1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.5～6扩增总真菌基因组DNA；
[0027](2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log
10
值，X表示循环数Ct值；
[0028]酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
[0029]总真菌：Y＝-0.2974X+10.345。
[0030]本专利技术还要求保护所述方法在研究黄酒发酵过程中微生物动态变化方面的应用。
[0031]有益效果：
[0032]1、本专利技术的方法操作更方便，与传统的平板涂布菌落计数方法相比节省时间；
[0033]2、本专利技术qPCR的检测结果准确性好，采用血球板计数法验证的结果与检测结果差异不大；具有良好的可重复性和回收率；
[0034]3、本专利技术可通过酿酒酵母的数量表征黄酒酿造过程中的黄酒微生物数量，可以有
For/Rev对黄曲霉进行qPCR扩增，根据Tm值(DNA双链解链50％的温度)和荧光信号值绘制溶解曲线，所有样品进行三个平行，通过溶解曲线是否为单一溶解峰和扩增曲本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种测定微生物数量的方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于酿酒酵母、黄曲霉或米曲霉；所述方法包括如下步骤：(1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.3～4扩增黄曲霉基因组DNA；(2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log
10
值，X表示循环数Ct值；酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；黄曲霉和/或米曲霉：Y＝-0.3137X+10.701。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测发酵产品中的微生物数量。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵产品为黄酒发酵醪液。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，提取待测样品的基因组DNA，再将基因组DNA用于步骤(1)的操作。5.一种定量检测微生物含量的试剂盒，其特征在于，含有(a)～(c)至少一组引物：(a)SEQ ID NO.1～2所示扩增酿酒酵母特异性片段的引物；(b)SEQ ID NO.3～4所示扩增黄曲霉和/或米曲霉的特异性片段的引物；(c)SEQ ID NO.5～6所示的扩增总真菌的特异性片段的引物。6.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomyces cerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Asper...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛健，张辉，刘双平，毛严根，王小壮，黄媛媛，彭金龙，张清文，周志磊，韩笑，
申请(专利权)人：上海金枫酒业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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