一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记及其方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种鉴别辽宁

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记及其方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记及其方法与应用。

技术介绍

[0002]黄芩是一种广泛使用的中药材，其以根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。黄芩的临床抗菌性比黄连好，而且不产生抗药性。据相关资料统计，目前市场上70％的中成药都含有黄芩，如常用的中成药清开灵口服液、双黄连颗粒/口服液/冻干粉针、银黄片/银黄颗粒/银黄口服液、小柴胡胶囊/小柴胡片/小柴胡颗粒、龙胆泻肝丸、固经丸等。黄芩产于河北、辽宁、吉林、内蒙古、山东、山西、陕西等地，不同产地的黄芩药材的药效质量差异较大。药材的“道地性”是由于各个地区生态环境差异导致药材的药效不同，特定的地理气候种植的特定的药材，才能更好地发挥药效，也是道地药材的精髓。
[0003]黄芩产地的鉴别一直是黄芩物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。目前黄芩产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。因此，需要一种能够鉴别辽宁-吉林地区黄芩的方法。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记物及其方法与应用。
[0005]一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包括10个SNP分子标记，所述10个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10所示。
[0006]进一步地，所述10个SNP位点的碱基如下所示。
[0007]一种利用SNP分子标记鉴别辽宁-吉林产黄芩的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获取待测样本DNA；对所述待测样本DNA测序，获得样本DNA测序数据；对所述样本DNA测序数据进行过滤，获得样本DNA序列；以黄芩在公共数据库中的基因组作为参考序列，将所述样本DNA序列与所述参考序列进行对比，获得样本群体SNP基因型，并对所述群体SNP基因型进行过滤获得样本SNP基因型；将上述鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记作为检测标准；判断所述样本SNP基因型是否达到检测标准的设定阈值：若达到并超过设定阈值，则样本属于辽宁-吉林片区，若未达到设定阈值，则样本不属于辽宁-吉林片区。
[0008]进一步地，所述待测样本DNA序列与所述参考序列进行对比包括：进一步地，所述将所述样本DNA序列与所述参考序列进行比对包括：利用对比软件进行序列比对，所用比对参数为mem
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[0009]进一步地，所述设定阈值为90%。
[0010]本专利技术还包括SNP分子标记在鉴别辽宁-吉林产黄芩中的应用。
[0011]本专利技术还包括含上述鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记的基因芯片或试剂盒。
[0012]本专利技术鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记物通过基因组学技术，在基因组层面获得SNP标记，采用本专利技术的SNP分子标记物能够快速准确的鉴别出产地为辽宁或吉林的黄芩，对不同产地黄芩进行筛选，鉴别准确度高、稳定性强、易于大范围推广应用。
[0013]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变
得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书和权利要求书中所指出的结构来实现和获得。
具体实施方式
[0014]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的多个实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0015]本专利技术鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记包括10个SNP分子标记，10个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10所示。
[0016]黄芩SNP分子标记的获取步骤如下：1、运用mCTAB法（modified CTAB method）对辽宁-吉林产黄芩叶片进行了DNA提取：(1) 取新鲜植物叶片100 mg放入2.0 mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，新鲜叶片浸入液氮中冻存1 min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用；(2) 在研磨好的材料中加入1.5 mL buffer A (0.1 M Tris-HCl pH 8.0; 5 mM EDTA; 0.25 M NaCl; 1 % PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合几次。10000
×
g离心后，弃掉上清液；(3) 重复步骤(2)一次，在沉淀中加入800 μL预热的2% CTAB(0.1M Tris-HCl pH8.0；1.4 M NaCl; 25 mM EDTA；2 % (w/v) CTAB; 0.2 %，(v/v ) β-巯基乙醇；1 % PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h.其间要颠倒均质溶液若干次；(4) 10000
×
g室温离心后，将上清液小心倒入一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI（氯仿：异戊醇=24:1(v/v)）溶液，在颠倒摇床上混合10 min；(5) 10000
×
g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10 min；(6) 10000
×
g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的1.5 mL离心管中加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20℃冰箱保存1小时以上；(7) 取出冰箱中的离心管，10000
×
g离心，弃去上清液，倒置于干燥纸上尽量控干液滴，加入100 μL的RNase 溶液(100 mg/L)，37℃保存0.5 h；(8) 在离心管中依次加入150 μL ddH2O，50 μL 5 M NaCl和700 μL无水乙醇，充分混合后10000
×
g离心，弃去上清，在纸上倒干；(9) 加入600 μL 70 %乙醇，弹底混合后离心，弃上清，重复一遍；(10) 真空干燥掉乙醇，加100 μL TE溶解DNA，并根据Nanodrop测定将样品DNA浓度并稀释至50ng/
µ
L。
[0017]2.建库测序检测合格的DNA样品随机打断成350bp的片段，采用华大自研试剂进行建库。库检合格后，根据文库的有效浓度和实际产出需求进行BGI-SEQ高通量测序，获得DNA测序原始数据。
[0018]DNA高通量测序可以采用任本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包括10个SNP分子标记，所述10个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述10个SNP位点的碱基如下所示。3.一种利用SNP分子标记鉴别辽宁-吉林产黄芩的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获取待测样本DNA；对所述待测样本DNA测序，获得样本DNA测序数据；对所述样本DNA测序数据进行过滤，获得样本DNA序列；以黄芩在公共数据库中的基因组作为参考序列，将所述样本DNA序列与所述参考序列进行对比，获得样本群体SNP基因型，并对所述群体SNP基因型进行过滤获得样本SNP基因型；将权利要求1-2中任意一项所述的鉴别辽宁-吉林产黄芩的SNP分子标记作为检测标准；判断所述样本SNP基因型是否达到检测标准的设定阈值：若达到并超过设定阈值，则样本属于辽宁-吉林片区，若未达到设定阈值，则样本不属于辽宁-吉林片区。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继永，郑司浩，曾燕，刘美娟，尚兴朴，赵莎，王浩，孙文静，刘国城，静一，朱亚兵，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：