本发明专利技术公开了一组（23个）与小麦抗寒性显著关联的SNP位点及其在遗传和育种中的应用方法。这些标记是通过对768份小麦品种和优良品系种进行简化基因组测序（GBS）并比对参考基因组序列鉴定出来的，SNP位点准确性好，这些位点可用于转化成单个的SNP标记（如KASP标记）和SNP芯片，用于小麦抗寒基因的定位、精细作图和候选基因克隆，以及小麦抗寒性的标记辅助选择、基因聚合及全基因组选择育种，广泛应用于小麦抗寒性遗传研究和育种工作。小麦抗寒性遗传研究和育种工作。小麦抗寒性遗传研究和育种工作。
【技术实现步骤摘要】
一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点及其在遗传育种中的应用
[0001]本专利技术涉及植物分子标记
，具体涉及一组与小麦抗寒基因位点显著关联的SNP及其在抗寒性的遗传及分子育种中的应用。
技术介绍
[0002]小麦的抗寒性指冬小麦幼苗冬季受冻害的情况。小麦是我国重要的粮食作物，主要分布在北纬30
°
以北。其中，包括我国小麦主产区黄淮冬麦区、北部冬麦区在内的我国北方冬麦区占全国麦田总面积的59%，该麦区冬季冷空气活动频繁，冬季绝对温度低,降水少，小麦越冬条件严酷，冻害成为影响小麦生产的一个重要因素。加之近年育成的品种趋向于矮秆大穗大粒，降低了抗寒性,进一步加重了冻害。目前冻害已成为威胁小麦生产的环境胁迫因素之一，严重影响小麦植株的生长发育和植株产量。因此，小麦植株的抗寒性是我国冬小麦生产和育种所要考虑的重要因素。
[0003]对小麦抗寒性进行遗传研究对了解这些性状的遗传结构、发掘关键抗寒基因、抗寒基因的作图与克隆，以及在育种中有效改良抗寒性具有非常重要的作用。分子标记技术是进行小麦有关性状的遗传、基因作图、标记辅助育种、基因组选择育种等育种研究中最常用的技术。常用的DNA分子标记有RFLP（限制性长度片段多态性），SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。传统的RFLP和SSR标记存在通量低、数量少、操作过程繁琐等局限，工作效率低，已不能满足大规模功能基因组学研究的需要。而SNP标记在基因组中分布及其丰富，具有二态性，且易于高通量自动化检测，是在遗传研究与育种中最有应用前途的分子标记技术。
[0004]目前，常用的SNP的高通量检测技术主要有测序和DNA芯片技术。利用测序技术对样品材料进行DNA重测序可以获得高密度的SNP标记，但重测序的成本很高。而简化基因组测序Genotyping-by-sequencing (GBS)则先对基因组DNA进行酶切等方法处理以减小基因组的复杂性，构建复杂性低的基因组DNA文库，再利用二代测序技术进行深度测序，一定程度上降低了测序的成本。小麦中利用两种限制性内切酶处理基因组DNA构建DNA文库并通过测序鉴定SNP的技术已经成熟。但是对于相对于小麦庞大的基因组（16G）要进行深度测序成本依然很高，而且GBS数据的处理、序列比对、基因分型等过程对数据分析的要求较高，需要有专业生物信息学背景的人员才能完成，一般育种家难以掌握和利用。
技术实现思路
[0005]控制小麦重要性状基因的作图、基因克隆以及分子标记辅助选择育种过程中需要开发大量分子标记。基于重测序及GBS等方法开发的SNP可以转化而成KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)标记，从而对单个SNP进行基因分型。KASP技术，也叫竞争性等位基因特异性 PCR 技术，能够在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。以其高度稳定性、准确性和低成本、高通量的特点，可广泛应用于
基因定位、基因的精细作图、克隆，大规模育种材料的高通量筛选，在遗传研究和分子标记辅助育种、基因组选择育种中具有重要利用价值。
[0006]针对现有技术的不足，本专利利用小麦中较为成熟的GBS技术，对768份小麦材料进行简化基因组测序，获得了覆盖全基因组高密度的SNP位点，通过全基因组关联分析鉴定出与抗寒性显著关联的SNP位点，可广泛应用于KASP标记的开发、基因定位、标记辅助选择与全基因组选择，服务于小麦抗寒性的遗传研究和分子育种。
[0007]本专利技术提供了一套与小麦抗寒性显著关联的SNP，可用于开发KASP标记和SNP芯片，广泛应用于小麦抗寒性相关基因的进一步精细作图与克隆、育种中的单个、多个抗寒性相关基因的标记辅助选择及全基因组选择育种。
[0008]本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术提供了一组（23个）与小麦抗寒性显著关联的单核苷酸多态性位点（SNP），包括SNP侧翼序列、SNP位点信息及碱基突变信息，这些SNP位于普通小麦13条染色体上。
[0009]1.一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点，其特征在于：所述的SNP位点包括23个SNP位点，编号分别为SNP01～SNP23，它们的信息如下：
表中物理位置以中国春基因组IWGSC reference genome v1.1 (IWGSC, 2018)为参考序列；表中所列序列见序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.46。
[0010]本专利技术提供的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点可以在小麦抗寒性鉴定中应用。
[0011]本专利技术提供的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点可以在制备小麦抗寒性鉴定试剂盒中应用。
[0012]本专利技术提供的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点可以在制备单个可检测的SNP标记或基因芯片中应用。
[0013]本专利技术提供的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点可以在制备与抗寒基因位点qCT5A.3共分离的KASP标记k5A520532和k5A523147中应用。
[0014]本专利技术提供的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点可以在小麦抗寒性鉴定检测
方法中应用。
[0015]具体应用中，我们可以根据SNP位点设计KASP引物，根据包含SNP位点上下游各50bp的DNA短序列设计KASP引物。具体利用网站PolyMarker (http://www.polymarker.info/)进行引物设计，采用网站默认的参数设置。引物前加接头，FAM序列为“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”，HEX序列为“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”。
[0016]引物设计合成后，可以利用分离群体或者自然群体进行有效性检测，验证通过GWAS鉴定到的QTL是否存在，应用于抗寒基因作图、标记辅助选择等研究，其使用方法分别如下：（1）以小麦DNA为PCR扩增模板，以设计合成的KASP引物，进行PCR扩增，反应体系为6μL。上述反应体系具体包括：20-50ng/μL的DNA 3μL，2
×
KASPMaster mix 3μL,KASP Assay mix(上下游引物混合液)0.0825μL。置于384孔PCR仪扩增。
[0017]（2）PCR扩增程序为:94℃预变性15min；94℃变性20s，65-57℃复性60s（每循环降低0.8℃），10个循环；94℃变性20s，57℃复性60s，30个循环；10℃保存；（3）PCR结束后，置于Omega SNP分型仪检测PCR分型结果；（4）分析鉴定，根据分型结果分析基因型。
[0018]本研究与现有技术相比有以下优点：（1）本专利技术鉴定了一组（23个）与小麦抗寒性显著关联的SNP。
[0019]（2）这些SNP可进一步转化为KASP标记，用于抗寒性相关基因的精细作图、克隆及大规模应用于育种材料的分子标记辅助高通量筛选，提高分子育种的效率。
[0020]（3）这些SNP也可制作成基因芯片，应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点，其特征在于：所述的SNP位点包括23个SNP位点，编号分别为SNP01～SNP23，它们的信息如下：表中物理位置以中国春基因组IWGSC reference genome v1.1 (IWGSC, 2018)为参考序列；表中所列序列见序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.46。2.根据权利要求1所述的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点在小麦抗寒性鉴定中的应用。3.根据权利要求1所述的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点在制备小麦抗寒性鉴定试剂盒中的应用。4.根据权利要求1所述的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点在制备单个可检测的SNP标记或基因芯片中的应用。5.根据权利要求1所述的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点在制备与抗寒基因位
点qCT5A.3共分离的KASP标记k5A520532和k5A523147中的应用。6.根据权利要求6所述的一组与小麦抗寒性显著关联的SNP位点在小麦抗寒性鉴定检测方法中的应用。7.根据权利要求4所述的检测方法中的应用，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：根据SNP位点设计KASP引物，根据包含SNP位点上下游各50bp的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘树兵，燕强，庞昀龙，刘春霞，王丹峰，路悦，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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