一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用，所述分子标记物包括40个SNP分子标记，所述40个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.40所示。本发明专利技术的鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用，采用基因组学技术，在甘草基因组层面获得SNP标记，能够快速准确确定所检测的甘草产地是否为甘肃产地。地是否为甘肃产地。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用。

技术介绍

[0002]甘草是一种大宗常用的中药材，其以根入药，味甘，平，有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。主治脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒等症，缓解药物毒性、烈性。甘草有“十方九草”一说，在中药各复方中出现最为频繁，主要为调和诸药的作用。甘草的主产区有内蒙古、甘肃、甘肃、宁夏等地，东北地区也有少量分布。不同产地的甘草药材质量和功效存在差异，且不同产地甘草的种子、药材等价格存在显著差异，甘肃是甘草主要的制种和繁种基地。
[0003]甘草产地的鉴别一直是甘草物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。当前甘草产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。
[0004]而对于甘草主产区的甘肃地区，如何将其生产的甘草与其他地区生产的甘草进行区分，是中药鉴别人员急需解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供了一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用。
[0006]一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物，所述分子标记包括40个SNP分子标记，所述40个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.40所示。
[0007]进一步地，所述40个SNP分子标记的碱基如下所示。
[0008]一种利用甘肃产甘草的SNP分子标记物鉴别甘草产地的方法，所述方法包括以下步骤：获取待测样本DNA；对检测合格的所述样本DNA进行建库测序，获得样本DNA测序数据；对所述样本DNA测序数据进行质控，获得样本DNA质控数据；将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重后，进行SNP检测得到所述待测样本SNP基因；将相同基因组位置处的所述待测样本SNP基因与甘肃产甘草的SNP分子标记进行比对，判断是否有19-20个所述待测样本SNP基因与所述甘肃产甘草的SNP分子标记SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20相同，同时继续判断是否有19-20个所述待测样本SNP基因与所述甘肃产甘草的SNP分子标记SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.40不同：若两次判断结果均为有，则判断待测样本为甘肃产地甘草；若任一次判断结果为没有，则所述待测样本为非甘肃产地甘草。
[0009]进一步地，所述样本DNA的测序采用高通量测序。
[0010]进一步地，所述对所述样本DNA测序数据进行质控包括：对所述样本DNA测序数据的原始reads进行过滤；所述过滤规则包括：去掉接头序列；去掉序列中N的数量小于等于序列长度2%的reads；去掉测序质量低于20的碱基数量超过序列长度的40%的reads。
[0011]进一步地，所述将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重后，进行SNP检
测得到所述待测样本SNP基因包括：以甘草在公共数据库中的基因组作为参考序列，利用比对软件进行序列比对，获得bam文件；利用排序软件对所述bam文件进行排序，并移除重复序列；利用基因分型软件处理排序去重之后的bam文件，获得待测样本初步SNP基因型；利用“QUAL>100 && FS<10 && MQ>40”参数降低所述样本初步SNP基因型的错误率，得到所述待测样本SNP基因型。
[0012]本专利技术还包含一种含上述SNP分子标记物在鉴别甘肃产甘草中的应用。
[0013]本专利技术还包含一种含上述SNP分子标记物的基因芯片或试剂盒。
[0014]本专利技术的鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用，采用基因组学技术，在甘草基因组层面获得SNP标记，能够快速准确确定所检测的甘草产地是否为甘肃产地。本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书和权利要求书中所指出的结构来实现和获得。
具体实施方式
[0015]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0016]甘草SNP分子标记的获取：1.DNA提取本实验运用了mCTAB法（modified CTAB method）对甘草叶片材料进行了DNA提取。具体提取步骤如下：(1) 取甘草新鲜植物叶片100 mg放入2.0 mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，将新鲜叶片浸入液氮中冻存1 min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用；(2) 在研磨好的材料中加入1.5mL buffer A (0.1M Tris-HCl pH 8.0；5mM EDTA；0.25 M NaCl；1%PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合3~10次。10000
×
g离心后，弃掉上清液；(3) 重复步骤(2)一次，在沉淀中加入800 μL预热的2% CTAB(0.1M Tris-HCl pH8.0；1.4M NaCl；25mM EDTA；2%(w/v) CTAB；0.2%(v/v) β-巯基乙醇；1% PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h，其间要颠倒均质溶液2~8次；(4) 10000
×
g室温离心后，将上清液小心倒入一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI（氯仿：异戊醇=24:1(v/v )）溶液，在颠倒摇床上混合10 min；(5) 10000
×
g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10 min；(6) 10000
×
g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的1.5 mL离心管中加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20℃冰箱保存1小时以上；(7) 取出冰箱中的离心管，10000
×
g离心，弃去上清液，倒置于干燥纸上尽量控干液
滴，加入100μL的RNase 溶液(100 mg/L)，37℃保存0.5 h；(8) 在离心管中依次加入150μL ddH2O，50μL 5M NaCl和700μL无水乙醇，充分混合后10000
×
g离心，弃去上清，在纸上倒干；(9) 加入600μL 70 %乙醇，弹底混合后离心，弃上清，重复一遍；(10) 真空干燥掉乙醇，加100 μL T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别甘肃产甘草的SNP分子标记物，其特征在于，所述分子标记物包括40个SNP分子标记，所述40个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.40所示。2.根据权利要求1所述的SNP分子标记物，其特征在于，所述40个SNP分子标记的碱基如下所示：
SEQ ID NO.20相同，同时继续判断是否有19-20个所述待测样本SNP基因与所述甘肃产甘草的SNP分子标记SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.40不同：若两次判断结果均为有，则判断待测样本为甘肃产地甘草；若任一次判断结果为没有，则所述待测样本为非甘肃产地甘草。4.根据权利要求3所述的利用甘肃产甘草的SNP分子标记物鉴别甘草产地的方法，其特征在于，所述样本DNA的测序采用高通量测序。5.根据权利要求3所述的利用甘肃产甘草的SNP分子标记物鉴别甘草产地的方法，其特征在于，所述对所述样本DNA测序数据进行质控包括：对所述样本DNA测序数据的原始reads进行过滤；所述过滤规则包括：去掉接头序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继永，邓庭伟，曾燕，郑司浩，尚兴朴，刘美娟，赵莎，王浩，高强，静一，刘国城，孙文静，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司国药种业有限公司，
类型：发明
国别省市：