用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用。所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上而成。利用本发明专利技术的大肠杆菌工程菌在微氧的条件下发酵廉价有机碳源如葡萄糖、蔗糖或甘油等，1,3-丁二醇相对于底物的得率可以达到0.4g/g以上，且R型1,3-丁二醇纯度达到99％以上，具有重要的工业应用潜力。要的工业应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体地说，涉及一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

技术介绍

[0002]1,3-丁二醇是一种具有重要工业应用价值的二元醇，其可以被用作化妆品的溶剂，同时可以用作单体来合成聚酯、聚氨酯及生物增塑剂。同时光学纯的1,3-丁二醇可以用作医药中间体来合成许多药物。但是化学法合成的1,3-丁二醇都是外消旋体，无法直接用作医药中间体。因此，利用生物法生产光学纯1,3-丁二醇具有重要应用价值。
[0003]CN201610481598.X和CN201080029715.X分别公开了两种1,3-丁二醇的生产方法，其主要是在厌氧条件下表达至少一种编码以足够的量表达的1,3-BDO通路酶的外源性核酸，以生产1,3-丁二醇。但该过程的生产效率低，1,3-丁二醇的最高产量低于2mM，不具有工业可行性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用。
[0005]本专利技术构思如下：提供一种重组大肠杆菌，其是通过上调大肠杆菌的pntAB基因并同时下调sthA基因从而极大提高细胞内的NADPH基因以满足1,3-丁二醇合成途径所需要的还原力NADPH，从而提高1,3-丁二醇的产量。本专利技术同时通过酶的设计构建了Clostridium saccharoperbutylacetonicum的丁醛脱氢酶突变体，其是将丁醛脱氢酶第273位亮氨酸突变为苏氨酸而成，在大肠杆菌中表达该突变体可以极大提高1,3-丁二醇的产量。本专利技术同时通过敲除adhE基因，ldhA基因，pta基因，ackA基因提高了乙酰-CoA流向1,3-丁二醇合成途径的代谢通量，进一步提高了1,3-丁二醇的产量。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上而成。
[0007]其中，所述phaA基因为乙酰CoA酰基转移酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
[0008](a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009](b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0010]所述phaB基因为3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：
[0011](c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012](d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。
[0013]所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
[0014]所述yqhD基因为醇脱氢酶基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：
[0015](e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0016](f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质。
[0017]所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)等中的菌种；优选大肠杆菌。
[0018]所述重组菌可按如下方法构建得到：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性转化子。
[0019]优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQ ID NO:5所示。
[0020]更优选地，所述重组菌的构建如下：将phaAB-bld2-yqhD串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化大肠杆菌(如W3110)，筛选阳性转化子。
[0021]其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。
[0022]第二方面，本专利技术提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以上述重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌。包括如下方案：
[0023]方案I：通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给。
[0024]优选地，所述与NADPH生物合成途径相关的基因为pntAB基因，核苷酸序列如下：
[0025]i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
[0026]ii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0027]iii)在严格条件下与SEQ ID NO:7所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0028]iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0029]本专利技术中，所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
[0030]1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
[0031]2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
[0032]3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
[0033]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
[0034]5)通过导入增强子而增强；
[0035]6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
[0036]方案II：弱化出发菌株中sthA基因，来提高细胞内NADPH的供给；
[0037]sthA基因的核苷酸序列如下：
[0038]i)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
[0039]ii)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0040]iii)在严格条件下与SEQ ID NO:8所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上而成；其中，所述phaA基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；所述phaB基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质；所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；所述yqhD基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质；其中，所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)中的菌种；优选大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性转化子；优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQ ID NO:5所示。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化大肠杆菌，筛选阳性转化子；其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。4.用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以权利要求2或3所述的重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌。5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给；优选地，所述与NADPH生...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，刘德华，刘煜，
申请(专利权)人：广东清大智兴生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：