联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。利用本发明专利技术提供的克雷伯氏菌工程菌，同时实现两种高附加值的二元醇(1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)的生产，且两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。目标产物分离过程更加简化，从而极大提高整个生产过程的经济效益。生产过程的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体地说，涉及一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

技术介绍

[0002]1,3-丙二醇是一种重要的二元醇，主要用作单体与对苯二甲酸聚合生产新型的聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。1,3-丙二醇可以通过微生物发酵的方法，利用天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等将甘油转化成1,3-丙二醇。由于克雷伯氏肺炎杆菌具有甘油代谢速率快、1,3-丙二醇产量高，能够耐受高浓度甘油和1,3-丙二醇，且发酵过程能在有氧条件下进行等特点，目前已被广泛应用于1,3-丙二醇的工业生产。
[0003]目前利用克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇主要存在的问题是发酵过程产生大量的副产物，如2,3-丁二醇，乳酸，丁二酸，乙醇，乙酸等，不但极大降低了1,3-丙二醇的得率同时使得后提取过程变的十分的复杂，极大增加了发酵及后提取过程的成本。因此，提高1,3-丙二醇的得率同时降低副产物的产量，对于降低1,3-丙二醇生产成本具有极其重要的意义。
[0004]1,3-丁二醇是另外一种具有重要工业应用价值的二元醇，其可以被用作化妆品的溶剂，同时可以用作单体来合成聚酯、聚氨酯及生物增塑剂。同时光学纯的1,3-丁二醇可以用作医药中间体来合成许多药物。但化学法合成的1,3-丁二醇都是外消旋体，无法直接用作医药中间体。因此，利用生物法生产光学纯1,3-丁二醇具有重要应用价值。
[0005]目前还没有任何报道能够直接利用微生物同时合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。
[0007]本专利技术构思如下：通过在克雷伯氏菌(如克雷伯氏肺炎杆菌)中引入1,3-丁二醇的生物合成途径，实现了在同一发酵过程同时生产两种具有重要工业价值的二元醇，使得两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。同时由于1,3-丁二醇与2,3-丁二醇竞争代谢底物且二者的分离十分困难，本专利技术通过阻断2,3-丁二醇的合成途径，完全消除了2,3-丁二醇的合成。本专利技术进一步通过敲除ldhA基因，adhE基因，mdh基因，消除了乳酸、乙醇、丁二酸的合成，使得重组克雷伯氏肺炎杆菌主要合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇两种产物，极大简化了后续提取的过程。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。
[0009]其中，所述phaA基因为乙酰CoA酰基转移酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
[0010](a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011](b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0012]所述phaB基因为3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：
[0013](c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014](d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。
[0015]所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
[0016]所述yqhD基因为醇脱氢酶基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：
[0017](e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0018](f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质。
[0019]优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，更优选保藏号为CGMCC NO.7824的克雷伯肺炎杆菌ACR30。公众可以通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)获得菌株ACR30。
[0020]所述重组菌可按如下方法构建得到：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子。
[0021]优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQ ID NO:5所示。
[0022]更优选地，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌(如ACR30)，筛选阳性转化子。
[0023]其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。
[0024]第二方面，本专利技术提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以上述重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌。
[0025]优选地，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给。
[0026]更优选地，所述与NADPH生物合成途径相关的基因为pntAB基因，核苷酸序列如下：
[0027]i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
[0028]ii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0029]iii)在严格条件下与SEQ ID NO:7所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0030]iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0031]本专利技术中，所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
[0032]1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
[0033]2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
[0034]3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
[0035]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
[0036]5)通过导入增强子而增强；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成；其中，所述phaA基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；所述phaB基因来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质；所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；所述yqhD基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质；优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，更优选保藏号为CGMCC NO.7824的克雷伯肺炎杆菌ACR30。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQ ID NO:5所示。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。4.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以权利要求2或3所述的重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌；优选地，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给；更优选地，所述与NADPH生物合成途径相关的基因为pntAB基因，核苷酸序列如下：i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经取代、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，刘德华，秦健淞，
申请(专利权)人：广东清大智兴生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：