一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种对棒杆菌中NCgl0609基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高氨基酸的发酵产量。所述点突变是使NCgl0609基因序列第1000位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，使编码的相应氨基酸第334位精氨酸被终止子所取代。代。

【技术实现步骤摘要】
一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L-赖氨酸(L-Lysine)应用范围广泛，包括医药、食品、饲料等各方面，其中被应用于饲料添加剂的L-赖氨酸占总量的90％以上。当前，我国是L-赖氨酸第二大消费市场，第一大L-赖氨酸生产国。
[0003]目前L-赖氨酸主要采用直接发酵法生产，直接发酵法利用具备完整L-赖氨酸生物合成途径的菌株，以废糖蜜、淀粉水解液等为底物，通过好氧发酵生产。该方法占当今世界L-赖氨酸生产的2/3，工艺已十分成熟，该方法主要存在于酵母、细菌、霉菌之中，在微生物中广泛存在。目前，工业上用于L-赖氨酸发酵的生产菌种主要是棒状杆菌和短杆菌属的诱变育种突变株。随着代谢工程和基因工程的发展，使得基因突变可控，因此在利用代谢工程改造出发菌株的过程中，能够精确找到代谢过程中L-赖氨酸生产的关键酶基因，然后提高关键酶基因的表达，L-赖氨酸产量的提高才有可能实现。
[0004]L-谷氨酸主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。L-谷氨酸本身可用作药物,参与脑内蛋白质和糖的代谢,促进氧化过程,该品在体内与氨结合成无毒的谷酰胺,使血氨下降,减轻肝昏迷症状。过去生产味精主要用小麦面筋(谷蛋白)水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是开发具有L-氨基酸生产能力的新菌株，从而提供一种有效生产L-氨基酸的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人通过研究发现，现有技术未知具有发酵氨基酸生产能力的NCgl0609基因通过修饰该基因或改善其表达，能够具备高效的L-氨基酸生产能力。基于这些发现，完成了本专利技术。
[0007]本专利技术提供了生成L-氨基酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达被改善。本专利技术还提供了通过使用所述微生物生产L-氨基酸的方法。
[0008]本专利技术的第一个方面提供了生成L-氨基酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。根据本专利技术，所述表达改善是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
[0009]所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl0609编码的蛋白。
[0010]所述细菌具有增强的L-氨基酸生产能力。
[0011]具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L-氨基酸的细菌。
[0012]所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。
[0013]可以通过如下手段增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
[0014]可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述被改善表达的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达改善是指编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第334位精氨酸替换为终止子。
[0021]根据本专利技术，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第334位精氨酸被终止子取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0022]在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第1000位碱基发生突变而形成的。
[0023]根据本专利技术，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1000位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。
[0024]在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
[0025]如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。
[0026]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列
的多核苷酸(NCgl0609基因)的启动子。
[0027]如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本专利技术中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生成L-氨基酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第334位精氨酸被终止子所取代。3.如权利要求1-2任一项所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。4.如权利要求1-3任一项所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第1000位碱基发生突变而形成的。优选的，所述突变包括SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第1000位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏爱英，孟刚，周晓群，赵春光，马风勇，贾慧萍，杨立鹏，苏厚波，
申请(专利权)人：内蒙古伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：