本发明专利技术公开了赖氨酸生产菌株的构建方法和应用。本发明专利技术提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤：在出发菌中，对SpeB蛋白、SecY蛋白和/或AtpB蛋白进行改造，获得与所述出发菌相比赖氨酸耐受能力提高和/或赖氨酸产量提高的工程菌。本发明专利技术提供了SpeB、AtpB、SecY蛋白的突变体，提高了赖氨酸的产量。本发明专利技术提供了过表达SpeB、弱化SecY的赖氨酸高产菌株的构建方法。本发明专利技术为赖氨酸生产菌株构建提供了全新的思路。思路。
【技术实现步骤摘要】
一种赖氨酸生产菌株的构建方法和应用
[0001]本申请是申请号为201910393041.4、申请日为2019年5月13日、专利技术创造名称为“赖氨酸生产菌株的构建方法和应用”的分案申请。
[0002]本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及赖氨酸生产菌株的构建方法和应用。
技术介绍
[0003]赖氨酸是动物和人体必需氨基酸，能促进人体发育、增强免疫能力，并有提高中枢神经组织功能的作用。人体不能靠自身合成L-赖氨酸，只能从食物中摄取，而谷物食品中的赖氨酸含量甚低，故也被称为第一限制性氨基酸，在医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。当前，赖氨酸主要通过埃希氏菌属(Escherichia)，棒杆菌属(Corynebavterium)、短杆菌属(Brevibacterium)等微生物发酵来生产。近年来，在大肠杆菌工程菌株构建生产赖氨酸方面已经有了大量的报道，如WO1994011517报道了解除赖氨酸反馈抑制的突变天冬氨酸激酶LysC，WO1995016042报道了解除赖氨酸反馈抑制的突变体DapA，CN101243177A报道了赖氨酸运输蛋白的过表达等等。因此，在公众已知的赖氨酸代谢相关的各个方面都已经进行了大量的改造和研发，当前赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到很高的水平。
[0004]众所周知，细胞是一个复杂的代谢网络集合体，在某一化合物的合成过程中人们通常对其代谢直接相关途径(包括底物运输、产物运输等)进行改造，而不会去改造细胞中的其他不相关的途径，因为不相关途径的改变对菌株造成的影响是不可知的，且细胞中的代谢途径众多，想要从众多的途径中挖掘出与赖氨酸生产相关的可改造点难度巨大，尤其是在当前赖氨酸工业菌株已达到高水平的情况下，想要进一步提升，甚至是小幅提升都十分困难。
技术实现思路
[0005]SpeB蛋白，胍基丁酸酶，催化胍基丁胺生成尿素和腐胺。AtpB蛋白，是ATP合酶F0复合体的亚基。SecY蛋白，Sec转运子亚基。以上三种蛋白都不在赖氨酸合成的主要代谢途径上，也不在糖酵解途径中，因此，本领域技术人员通常不会想到这些蛋白的改造是否对赖氨酸生产有利。在申请前期大量的研究中，通过菌株的赖氨酸耐受性筛选获得了一株能够耐受高浓度赖氨酸的菌株，在对菌株的基因组测序和比较基因组分析后，发现该菌株中的SpeB蛋白、AtpB蛋白、SecY蛋白发生了点突变，并且这些突变体能够提高赖氨酸的产量，在此基础上完成了本专利技术。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护一种构建赖氨酸耐受能力和/或赖氨酸产量提高的工程菌的方法。
[0007]本专利技术所要求保护的构建工程菌的方法，可包括如下步骤：在出发菌中，对SpeB蛋白、SecY蛋白和/或AtpB蛋白进行改造，获得与所述出发菌相比赖氨酸耐受能力和/或赖氨
酸产量提高的工程菌。
[0008]其中，所述“在出发菌中，对SpeB蛋白、SecY蛋白和/或AtpB蛋白进行改造”可为对所述出发菌内源的SpeB蛋白、SecY蛋白和/或AtpB蛋白进行直接改造，也可为对外源的SpeB蛋白、SecY蛋白和/或AtpB蛋白进行改造后导入所述出发菌。
[0009]在所述出发菌中，对所述SpeB蛋白进行的改造可为如下任一：
[0010](a1)过表达所述SpeB蛋白；
[0011](a2)过表达SpeB
A302V
蛋白；所述SpeB
A302V
蛋白为将所述SpeB蛋白的第302位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)后得到的蛋白质；
[0012](a3)将所述SpeB蛋白的第302位的丙氨酸突变为缬氨酸。
[0013]在所述出发菌中，对所述SecY蛋白进行的改造可为如下任一：
[0014](b1)抑制所述SecY蛋白的表达；
[0015](b2)将所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸(M)突变为缬氨酸；
[0016](b3)将所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg。
[0017]在所述出发菌中，对所述AtpB蛋白的改造可为如下任一：
[0018](c1)过表达AtpB
S165N
蛋白；所述AtpB
S165N
蛋白为将所述AtpB蛋白的第165位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)后得到的蛋白质；
[0019](c2)将所述AtpB蛋白的第165位的丝氨酸突变为天冬酰胺。
[0020]在本专利技术的具体实施方式中，所述方法具体为如下任一：
[0021]方法A，包括如下步骤：在所述出发菌中过表达所述SpeB蛋白，得到所述工程菌。
[0022]方法B，包括如下步骤：在所述出发菌中过表达所述SpeB
A302V
蛋白，得到所述工程菌。
[0023]方法C，包括如下步骤：在所述出发菌中过表达所述AtpB
S165N
蛋白，得到所述工程菌。
[0024]方法D，包括如下步骤：抑制所述出发菌中所述SecY蛋白的表达，得到所述工程菌。
[0025]方法E，包括如下步骤：将所述出发菌中的所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸突变为缬氨酸，得到所述工程菌。
[0026]方法F，包括如下步骤：将所述出发菌中的所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg，得到所述工程菌。
[0027]方法G，包括如下步骤：将所述出发菌中的所述SpeB蛋白的第302位的丙氨酸突变为缬氨酸，所述AtpB蛋白的第165位的丝氨酸突变为天冬酰胺，所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸突变为缬氨酸，得到所述工程菌。
[0028]进一步地，在本专利技术的具体实施方式中，过表达所述SpeB蛋白是通过向所述出发中导入所述SpeB蛋白的编码基因来实现的。
[0029]进一步地，在本专利技术的具体实施方式中，过表达所述SpeB
A302V
蛋白是通过向所述出发中导入所述SpeB
A302V
蛋白的编码基因来实现的。
[0030]进一步地，在本专利技术的具体实施方式中，抑制所述出发菌中所述SecY蛋白的表达是通过向所述出发菌中导入靶向所述SecY蛋白的编码基因的第1-24位核苷酸的sRNA实现的。
[0031]进一步地，在本专利技术的具体实施方式中，将所述出发菌中的所述SecY蛋白的第145
位的蛋氨酸突变为缬氨酸是通过向出发菌中导入secY433片段实现的，所述secY433片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。其中，SEQ ID No.7的第1-442位和1435-2804位为第一次同源重组的两端同源臂，第443-482位和1395-1434位为第二次重组的同源序列，483-1394位为氯霉素抗性基因加N20PAM片段。
[0032]进一步地，在本专利技术的具体实施方式中，将所述出发菌中的所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg通过向出发菌中导入secYgtg片段实现的，所述secYgt本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种构建工程菌的方法，包括如下步骤：在出发菌中，对SecY蛋白进行改造，获得与所述出发菌相比赖氨酸耐受能力和/或赖氨酸产量提高的工程菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述出发菌中，对所述SecY蛋白进行的改造为如下任一：(b1)抑制所述SecY蛋白的表达；(b2)将所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸突变为缬氨酸；(b3)将所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法为如下任一：方法A，包括如下步骤：抑制所述出发菌中所述SecY蛋白的表达，得到所述工程菌；方法B，包括如下步骤：将所述出发菌中的所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸突变为缬氨酸，得到所述工程菌；方法C，包括如下步骤：将所述出发菌中的所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg，得到所述工程菌。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：抑制所述出发菌中所述SecY蛋白的表达是通过向所述出发菌中导入靶向所述SecY蛋白的编码基因的第1-24位核苷酸的sRNA实现的；和/或将所述出发菌中的所述SecY蛋白的第145位的蛋氨酸突变为缬氨酸是通过向出发菌中导入secY433片段实现的，所述secY433片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；和/或将所述出发菌中的所述SecY蛋白的编码基因的起始密码子atg突变为gtg通过向出发菌中导入secYgtg片段实现的，所述secYgtg片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌为赖氨酸生产菌株；进一步地，所述出发菌为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。6.如下任一生物材料：(I)蛋白；所述蛋白为SecY
M145V
蛋白；所述SecY
M145V
蛋白为将SecY蛋白的第145的蛋氨酸突变为缬氨酸后得到的蛋白质；(II)基因；所述基因为所述SecY
M145V
蛋白的编码基因；(III)DNA片段，为secY433片段或者secYgtg片段；所述secY433片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述secYgtg片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；(III)表达盒；所述表达盒为含有所述SecY
M145V
...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙际宾，李庆刚，郑平，王晓玮，周文娟，陈久洲，王钰，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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