转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用，属于生物技术领域。该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)L1

【技术实现步骤摘要】
转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用


[0001]本专利技术涉及利用分子生物学技术，通过重构嗜木质素芽孢杆菌菌株的代谢途径获得能够大量蓄积香草醛的嗜木质素芽孢杆菌基因工程菌(以下简称基因工程菌)，实现将含木质素类生物质或者工业木质素及它们的解聚产物转化合成香草醛的方法，属于生物


技术介绍

[0002]香草醛(Vanillin，C8H8O3)，学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香兰素，是世界上产量最大、用途最广的广谱型高档香料，应用于食品、日化、橡胶、塑料和医药等行业。
[0003]化学合成方法合成香兰素是市场主要香兰素的来源，年产量已经高达20000吨，但是化学合成香兰素虽然成本低廉，规模大，但是容易造成环境污染，且不能满足人们对天然食品的要求。
[0004]天然香兰素目前主要通过香荚兰豆提取获得，但是由于香荚兰种植中需要人工授粉，劳动强度大，难以大规模种植。目前香荚兰的种植量每年仅仅在2000-3000吨左右，提取的天然香兰素的产量仅仅20吨左右，市场售价高达3200美元/kg。近年来消费者对天然香兰素的需求越来越大，并且一些国外(例如欧洲)的立法机构，建议在食品中使用天然香兰素，但用植物组织提取的方法产率低、成本高、造成了天然香兰素的紧缺。
[0005]微生物降解转化木质素，具有转化法工艺简单，收率较高、能耗低、产品安全等优点。美国食品药品监督管理局规定“天然香料必须是来自于植物或动物的原料，经物理、酶法或者微生物加工过程得到的产品”。因此，微生物法转化合成香兰素，将是今后发展的重要趋势。
[0006]木质素作为全球最丰富的天然芳香化合物的主要来源，长久以来未得到重视和利用。如何将木质素成分转变为高值化产品是提高解聚木质素综合利用的一个可行途径。木质素解聚产物中含有大量的阿魏酸、肉桂酸、香草酸、香草醛和香豆酸等芳香化合物。通过生物方法将木质素中的芳香化合物转化为特定单一的芳香化合物，对实现木质素的高值化利用具有重要的现实意义，也是实现农林业可持续发展的要求。木质素化学降解分离纯化香草醛已经有不少相关报道，例如碱性条件下氧化解聚木质素后再提取分离获得香草醛，缺点是使用的催化剂主要为贵金属和过渡金属基催化剂，成本较高并且分离纯化困难，并且容易造成污染，因此很难得到工业应用。通过生物方法在温和条件下将木质素转化为香草醛，避免了使用催化剂和产生环境污染物，是未来利用木质素转化生产香兰素可行的方法之一。之前有报道构建的工程菌Rhodococcus jostii RHA045可以利用麦草秸秆和葡萄糖做原料生产香草醛，6天的发酵后可以达到96mg/L的产量(Paul D.Sainsbury,et al.ACS chemical biology,2013,8,2151-2156)。但是这株菌不能利用木质素做单碳源，使用碱性木质素做碳源发酵48-72小时，仅仅得到1.0-1.3g/L的香草醛，显然这株菌不适合利用木质素生产香兰素。而且6天的过长发酵时间也影响了香兰素生产的效率，所以难以实现木质素转化香兰素的生产。
[0007]嗜木质素芽孢杆菌L1是在深海沉积物中筛选到的一株嗜碱耐盐的极端微生物，其能够在pH 7-11的环境中生存，L1生长适应性强(10-50℃、pH 6.0-11.0、0-10％NaCl，最适生长pH 9)，是目前已知的木质素降解菌中对碱耐受性最高菌株之一。我们前期研究表明：香草醛和香草酸是β-芳基醚、联苯、二芳基丙烷和阿魏酸等途径的共同中间产物，在L1解聚碱性木质素的芳香产物中占比高达30-44.2％(Zhu D,et al.Biotechnology for Biofuels,2017,10(1):44)。表明香草醛是木质素生物解聚和转化最理想的目标产物之一。香草醛可以通过香草醛脱氢酶转化为香草酸。因此，敲除香草醛脱氢酶基因，阻断香兰素的降解，能够实现香兰素的大量积累。
[0008]本专利技术所要解决的技术问题是通过构建基因工程菌株，提供一种高效的将木质素类生物质及其解聚产物转化制备香草醛的方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的是公开一种将木质素包括各种工业木质素和造纸黑液等廉价物质转化为高附加值的芳香化合物香草醛的方法，本专利技术所述的方法解决了木质素的高值化利用瓶颈，实现了生物转化合成香草醛，具有重要的工业价值。
[0010]本专利技术公开了一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌，该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)L1-vdh,其已于2019年12月20日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议的分类命名为Bacillus ligniniphilus，保藏号为：CGMCC No.19226。
[0011]应用上述一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，按照下述步骤进行：
[0012](1)木质素解聚混合物的制备：将工业木质素或者预处理后的含木质素预处理液采用热裂解方法、酶解聚方法、微波、金属催化剂裂解方法、碱水解方法等方法的一种处理，达到解聚木质素的目的，解聚反应液pH调至中性备用。
[0013]其中步骤(1)所述的热裂解方法：将不高于10％(v/v)的木质素水溶液在反应釜中以250-450℃的温度热裂解5-30分钟。压力控制在30兆帕以内。
[0014]其中步骤(1)所述的酶解聚方法：将漆酶以0.1g/L的浓度溶解有乙酸盐缓冲液(pH 4)中，然后将漆酶溶液以1:1(v/v)比例与10％的木质素溶液混合均匀，在30℃下反应12小时。
[0015]其中步骤(1)所述的碱水解方法：将不高于10％(g/v)的氢氧化钠溶液加入木质素(溶液中木质素含量不超过10g/L)，在80-100℃下处理1-6h。
[0016]其中步骤(1)所述的金属催化剂裂解方法：以金属催化剂(镍、钛、锌等)为催化剂，在10％的木质素溶液体系中100-300℃下处理0.5-1h。将木质素以1-10％(g/L)的浓度溶解于2-10％NaCl溶液当中，然后在反应釜中60-200℃反应1-3小时后收集滤液备用。
[0017](2)将嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)的基因工程菌L1-vdh(保藏号：CGMCC No.19226)冻存管接种到含有卡那霉素(50μg.ml-1
)的2216E培养基中37℃活化预培养24h，然后按照1:10(V/V)的比例接入发酵培养基在发酵罐内37℃培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，培养过程中通过补料方式在葡萄糖低于5g/L的时候补充葡萄糖，在发
酵OD值30以上时停止发酵，然后将发酵液置换为以木质素解聚产物为单碳源的MM63培养基，在37℃继续培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，以HPLC检测香草醛合成量。
[0018]其中步骤(2)2216E培养基成分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌，该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)L1-vdh，建议的分类命名为Bacillus ligniniphilus，保藏号为：CGMCC No.19226。2.利用权利要求1所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)木质素解聚混合物的制备：将工业木质素或者预处理后的含木质素预处理液采用热裂解方法、酶解聚方法、微波、金属催化剂裂解方法、碱水解方法等方法的一种处理，达到解聚木质素的目的，解聚反应液pH调至中性备用；(2)将嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)的基因工程菌L1-vdh(保藏号：CGMCC No.19226)冻存管接种到含有卡那霉素(50μg.ml-1
)的2216E培养基中37℃活化预培养24h，然后按照1:10(V/V)的比例接入发酵培养基在发酵罐内37℃培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，培养过程中通过补料方式在葡萄糖低于5g/L的时候补充葡萄糖，在发酵OD值30以上时停止发酵，然后将发酵液置换为以木质素解聚产物为单碳源的MM63培养基，在37℃继续培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，以HPLC检测香草醛合成量；(3)发酵液通过离心或者陶瓷膜过滤收集上清液，置入储罐备用；收集的菌体通过高压均质机破碎细胞，然后通过陶瓷膜过滤收集上清液，然后与发酵液上清液合并置入储罐；(4)上清液通过聚砜超滤膜除去杂蛋白、多肽、多糖等其它聚合物，收集滤液；(5)滤液经有机溶剂萃取、浓缩、结晶等常规步骤制备香草醛。3.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的热裂解方法：将不高于10％(v/v)的木质素水溶液在反应釜中以250-450℃的温度热裂解5-30分钟；压力控制在30兆帕以内。4.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的酶解聚方法：将漆酶以0.1g/L的浓度溶解有乙酸盐缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱道辰，孙建中，朱彬，许令侠，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：