一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用制造技术

发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用。所述菌株采用的宿主细胞是在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709的基础上，通过敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并删除9个基因组岛以实现宿主细胞的基因组精简来构建的。在经过改造的宿主菌种构建整合aprE表达盒，双拷贝的重组菌比宿主的酶活力提高37.45％，三拷贝的重组菌比双拷贝的重组菌酶活力提高9.36％。活力提高9.36％。活力提高9.36％。

【技术实现步骤摘要】
一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用

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[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用。

技术介绍
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[0002]B.licheniformis 2709工业微生物，来源于土壤等自然环境，进化过程中形成一系列未经驯化的不良特性，包括：1)发酵过程中易形成泡沫，导致极高的发酵污染风险；2)营养缺陷时易形成芽孢，影响目标产物的进一步积累并增加发酵设备的消杀成本；3)形成大量粘性物质，阻碍菌体生长和产物合成，在大规模化工业生产中增加搅拌与溶氧的需求；4)分泌合成大量的胞外蛋白等，这无疑严重影响目标产物的合成与积累，增加了工业化操作的要求与难度，不利于工业化生产的整体效益。
[0003]近年来，为获得性能优良的工业微生物细胞工厂，学者们在生产菌株的遗传改良方面开展了深入的研究。Zhang等人通过敲除影响泡沫形成的脂肽编码基因 srfA，优化了未经驯化的野生菌株B.subtilis ATCC 6051a的生产性能；Illing等人通过删除芽孢形成关键控制基因sigE提高了酶的合成能力；模式菌B.subtilisWB
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属于多重蛋白酶缺陷型菌株，这明显促进其它胞外分泌蛋白的积累。
[0004]此外，B.licheniformis理论上可以从基因组精简中获益更多，因为它能够合成大量的对细胞生命活动非必需的次级代谢产物。因此，从分子水平对工业微生物宿主进行分子改良，对微生物细胞生产性能的提升具有重要意义。
[0005]基因组精简工程主要在原核细胞中进行，尤其是E.coli和B.subtilis等模式菌株，并取得了一定的成果，未见针对工业菌株B.licheniformis 2709基因组精简的报道。分析宿主的基因组发现，存在大量的孤岛基因、冗余基因、假基因等非必需基因，以及控制次级代谢产物合成的基因，这大大增加了细胞代谢负担和能耗，导致营养资源浪费，进而影响细胞的生长与发酵性能。因此，通过小基因组技术实现在特定培养基中底盘细胞的构建，是可行且有价值的。
[0006]目前，基因组精简工程主要在原核细胞中进行，未见针对工业菌株B. licheniformis 2709基因组精简的报道。分析宿主的基因组发现，存在大量的孤岛基因、冗余基因、假基因等非必需基因，以及控制次级代谢产物合成的基因，这大大增加了细胞代谢负担和能耗，导致营养资源浪费，进而影响细胞的生长与发酵性能。
[0007]本专利技术通过分析鉴定影响宿主发酵生产的不良性能，确定相关控制基因，采用建立的遗传操作系统高效删除相关编码基因，以消除宿主细胞不良的生产特征，提升其发酵生产性能；并结合宿主细胞的基因组信息，分析确定可能的孤岛基因等非必需基因，采用小基因组技术，实现有效的基因组精简，为构建适用于工业化生产酶制剂的底盘细胞奠定基础。

技术实现思路
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[0008]为了实现上述目的，本专利技术首先将提供一株适用于工业化生产的地衣芽孢杆菌宿主菌，所述菌株是在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709的基础上，通过敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并删除9个基因组岛以实现宿主细胞的基因组精简来构建的；
[0009]所述eps基因位于GenBank CP033218中的地衣芽孢杆菌2709即 TCCC11148全基因组序列上第1967676-1983603位；
[0010]所述pgs基因位于GenBank CP033218中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第1805920-1808919位；
[0011]所述sigF基因的Genbank编号为CP033218.1(位于全基因组序列上第 3898937-3899704位)；
[0012]所述chiAB基因中的chiA基因的Genbank编号为WP_003178684.1，chiB基因的Genbank编号为WP_003178682.1(chiAB基因位于全基因组序列上第 909808-913767位)；
[0013]所述pulA基因的Genbank编号为WP_009329394.1(位于全基因组序列上第 2420607-2422739位)；
[0014]所述amyA基因的Genbank编号为WP_025807921.1(位于全基因组序列上第582978-584516位)；
[0015]所述lchAC基因中lchA基因的Genbank编号为WP_020450107.1，lchC基因的Genbank编号为WP_016886081.1(lchAC基因位于全基因组序列上第第 834378-849050位)；
[0016]所述upp基因的Genbank编号为WP_026589089(位于全基因组序列上第 1714807-1715436位)；
[0017]所述9个基因组岛，分别为位于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709 基因组上第3,429,766-3,435,147位的GI01；第3,671,385-3,675,741位的GI02；第3,708,534-3,716,479位的GI03；第4,292,644-4,304,905位的GI04；第 4,305,616-4,341,077位的GI05；第1,117,114-1,157,920位的GI06；第 3,560,703-3,567,132位的GI07；第4,071,504-4,088,125位的GI08；第 1,933,894-1,951,991位的GI09，上述位置编号对应GenBank CP033218中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709即TCCC11148全基因组序列位置编码。
[0018]本专利技术还提供上述地衣芽孢杆菌宿主细胞的应用，特别是在表达碱性蛋白酶 AprE中的应用。
[0019]本专利技术提供的另一技术方案，是一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌，是以上述敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并删除9个基因组岛的地衣芽孢杆菌为宿主细胞，在染色体位置I(aprE中心对称位置基因组第(2419710-2422710bp))整合aprE后构成携带两个表达盒的突变体菌株 GR15-2；以及在GR15-2的基础上，在染色体位点III(复制起始位点中心对称的位置基因组第(3396863-3397860bp))整合aprE后构成携带三个表达盒的突变体菌株GR15-3。
[0020]所述aprE基因的Genbank编号为CP033218；
[0021]本专利技术还提供菌株GR15-2和菌株GR15-3生产碱性蛋白酶aprE的方法：
[0022]发酵培养基：高峰氏淀粉酶0.7g/L，玉米粉64g/L，豆粕40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷
酸二氢钾0.3g/L。
[0023]摇瓶发酵：将菌株在LB平板上进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1715436位)。9.如权利要求1所述的一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，chiAB、pgs、lchAC、eps、upp基因和9个基因组岛的敲...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，房红磊，周翠霞，张会图，李玉，刘逸寒，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：