AroG的突变体及其在产氨基酸基因工程菌中的应用制造技术

本发明专利技术AroG的突变体及其在产氨基酸基因工程菌中的应用，公开了一种3

【技术实现步骤摘要】
AroG的突变体及其在产氨基酸基因工程菌中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物领域，具体涉及AroG的突变体和调控因子RpoS的失活在产色氨酸的基因工程菌的构建中的应用，以及使用其发酵生产色氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]L-色氨酸作为人体内的一种必需氨基酸，可以合成色素、5-羟基色胺、吲哚等重要的生物活性物质，于医药、食品、饲料等行业有广泛的应用。目前，世界市场色氨酸的年需求量在万吨以上，并以每年10％的速度增长。在医学领域，L-色氨酸广泛应用于氨基酸注射液、必需氨基酸药品及水解蛋白质的添加剂等。L-色氨酸的转化产物5-羟色胺，具有抗抑郁症、提高睡眠质量、抗高血压及镇痛作用。作为食品添加剂，L-色氨酸可以强化机体对植物蛋白的利用效率。在饲料中添加L-色氨酸，可以调节饲料中氨基酸的平衡，促进家禽家畜的生长。
[0003]L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法。化学合成法由于存在工艺复杂、产品成分复杂等原因，已逐渐被淘汰。而酶转化法和微生物转化法虽然已经实现了工业化，但仍然存在原料昂贵、低转化率等问题。通过葡萄糖等廉价原料来生产L-色氨酸的微生物发酵法是最早开发的L-色氨酸生产方式，但这种方法在很长的一段时期内都无法实现工业化。究其原因，主要是在早起的研究中，研究者单一依靠传统的化学或物理诱变方式选育L-色氨酸生产菌株，而经过多轮的化学或物理诱变以后，很难确认诱变过程中次级突变对菌株的影响，背景相对不清晰，进而阻碍了菌种的进一步改良。90年代以来，随着DNA重组技术的快速发展，特别是代谢工程育种方式的兴起，研究者逐渐选育出一批高产的L-色氨酸生产菌株，大幅提高了微生物发酵法生产L-色氨酸的效率，使其成为工业上主要的L-色氨酸生产方法。
[0004]近年来，随着代谢工程、转录组学和合成生物学的发展，人们通过分析代谢途径，过量表达内源基因或引入外源基因，消除竞争支路，成功构建了合成特定目标化合物并用于工业化生产的工程菌株。目前代谢工程在微生物合成氨基酸、有机酸、萜类化合物、聚羟基脂肪酸酯、生物燃料等领域得到了广泛的应用。大肠杆菌因其易于培养、遗传背景清楚、遗传操作简便等优点被大规模应用于代谢工程改造用于合成各种有价值的化合物。
[0005]由于具有原料廉价、产物纯度高、易提取等优点，微生物发酵法生产L-色氨酸受到了越来越多的关注。随着基因重组技术的发展，利用基因工程手段改造L-色氨酸合成途径逐步发展起来。在不涉及化学诱变的情况下，赵志军等运用代谢工程的研究策略，在不产L-色氨酸的E.coli W3110的基础上，通过一系列的基因操作，使L-色氨酸的产量提高至17.7g/L(赵志军.L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究[D].无锡:江南大学,2011.)。2017年，Chen等通过基因工程纯理性改造的方法得到高产L-色氨酸菌株S028，通过发酵61h，L-色氨酸产量达到了40.3g/L(Chen L et al.,Applied microbiology and biotechnology,2017,101(2):559-568.)。而在1993年，Syoji Azuma等在发酵培养时添加pluronic L-61使L-色氨酸结晶，从而使L-色氨酸产量达到了54.5g/L(Azuma S et al.,
Applied Microbiology and Biotechnology,1993,39(4-5):471-476.)。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于通过基因工程的方法对细菌尤其大肠杆菌中氨基酸相关代谢途径基因进行改造，从而获得色氨酸生产菌株。
[0007]本专利技术的目的在于通过基因工程的方法对细菌(尤其大肠杆菌)的氨基酸相关代谢途径基因进行改造，从而获得提高色氨酸产量的生产菌株。
[0008]本专利技术的提供产色氨酸的基因工程细菌的制备方法，其是通过定点突变将出发细菌中3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶AroG进行突变，以解除苯丙氨酸对AroG的抑制作用，优选地是将AroG的第211位氨基酸残基由S突变成F；同时，将出发细菌中的调控因子RpoS进行失活或敲除，最终得到产色氨酸的基因工程细菌。由此可以的提高细菌的色氨酸的产量提高。这是由于AroG本身是这些氨基酸代谢生产共同途径中的关键一步，同时研究发现将调控因子RpoS失活，能够有效提高细菌的色氨酸的产量。其中，所述出发细菌是大肠杆菌。
[0009]在具体的实施方式中，通过构建含有编码所述突变的AroG的基因的表达载体导入出发细菌中实现，或者通过基因编辑方法等对细菌中本来的AroG编码基因进行定点突变，以使得编码的蛋白的第211位氨基酸残基由突变为F。
[0010]上述方法中，所述对调控因子RpoS进行失活，其是通过基因编辑方法实现，在一个具体实施方式中，是将其中氨基酸序列第33位残基进行无义突变。
[0011]在优选的实施方式中，所述出发细菌中，通过基因工程方法以使其过表达ppsA基因和/或同时敲除或失活trpR基因。其中过表达ppsA基因可以通过导入含有ppsA基因的表达载体实现，或通过基因编辑的方法在出发细菌的基因组上引入tac启动子以过表达ppsA基因；失活或敲除trpR基因是通过基因编辑，干扰RNA等技术来实现。
[0012]在进一步的优选实施方式中，在所述基因工程细菌中进一步敲除或失活色氨酸降解途径色氨酸酶TnaA，降低L-色氨酸的分解代谢，达到富集终产物L-色氨酸的目的。所述敲除或失知是通过基因编辑，干扰RNA等技术来实现。
[0013]本专利技术进一步提供由上述方法获得的基因工程细菌。优选地，其中大肠杆菌。
[0014]本专利技术还提供上述基因工程细菌在制备色氨酸中的应用。
[0015]在具体实施方式中，通过对所述基因工程菌进行发酵，然后收集色氨酸的步骤，具体是从发酵上清液中收集色氨酸。其中将所述基因工程菌经过38-42h发酵培养后，从酵液上清中收集色氨酸。更优选地，还包括纯化色氨酸的步骤。
[0016]利用本专利技术获得的基因工程菌进行发酵，可以获得色氨酸的有效积累，为它们的产业化生产奠定了基础。
附图说明
[0017]图1：PH5a-aroG-trpEDCBA质粒图谱。
[0018]图2：L-色氨酸生产菌株摇瓶发酵结果。
[0019]图3：L-色氨酸生产菌株摇瓶发酵OD
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结果。
具体实施方式
[0020]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。
[0021]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0023]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0024]突变体AroG(S211F)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示,实施例中采用的所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产色氨酸的基因工程细菌的制备方法，其特征在于，是通过定点突变将出发细菌中3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶AroG进行突变，以解除苯丙氨酸对AroG的抑制作用，其是通过构建含有编码所述突变的AroG的基因的表达载体导入出发细菌中，或者通过基因定点突变将出发细菌中的AroG编码基因进行所述突变；同时，将出发细菌中的调控因子RpoS进行失活，最终得到产色氨酸的基因工程细菌。2.如权利要求1所述这的制备方法，其特征在于，所述出发细菌是大肠杆菌。3.如权利要求1所述这的制备方法，其特征在于，所述3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶AroG的突变是指将AroG的第211位氨基酸残基由S突变成F。4.如权利要求1所述这的制备方法，其特征在于，所述对调控因子R...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，丁冬芹，柏丹阳，朱亚如，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：