检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法技术

本发明专利技术提出了检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼方法，包括：将修饰有参与细胞某生命活动的物质A的第一类纳米颗粒、修饰有参与细胞此生命活动的物质B的第二类纳米颗粒导入细胞，在生命活动过程中，物质A与B结合，二者所修饰的纳米颗粒形成二聚体，诱导产生物质A与物质B的二聚体的表面增强拉曼散射，由于二聚体表面增强拉曼散射强度与普通拉曼散射存在数量级上的差异，通过拉曼光谱扫描观测信号强度，确认活体细胞内生命活动的发生场所，实现活体细胞生命活动分析。利用本发明专利技术的方法有助于准确检测分析活体细胞生命活动，具有检测准确性强、重复性好等优点，具有科学研究和临床应用价值。有科学研究和临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法


[0001]本专利技术涉及活体细胞成像检测
，具体的，本专利技术涉及检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法。

技术介绍

[0002]细胞是生命活动的基本单元，细胞内的信息变化是疾病发生的最早期信息。在病毒、药物等不同刺激源的刺激下，研究细胞内部特定生命活动产生位置、持续时间及反应物的变化，有望从源头解释生物体病变和治愈的过程，还可以迅速验证药物影响。因此，对活体细胞内部生命活动的定向成像研究对生物学和药学的发展具有十分重要的意义。
[0003]细胞内生命活动的最小载体为单分子。现有活体细胞单分子检测的方法主要包括荧光成像及光谱学，以及光阱、磁阱和原子力显微镜为代表的力学检测方法。其中，单分子荧光检测技术是现有的发展最充分、最成熟的单分子检测方法，通过单分子荧光检测方法，已经可以实现对DNA、miRNA等物质的定量检测。然而，荧光检测方法仍存在一些缺陷：首先，许多细胞存在自发荧光，而上述自发荧光会对目标荧光蛋白的发光产生干扰，导致无法有效成像；其次，当目标检测物含量较少时，荧光信号较弱，信号可能无法有效检测；再次，当荧光标记进入细胞之后，其可能不与目标抗原结合，而是游离在细胞内，产生非特异性测量结果，无法确认目标抗原的真实位置。更重要的是，现有的荧光成像方法，往往仅被应用于单分子存在性表征，很难直接体现细胞内部生命活动的发生情况，例如，现有的荧光成像技术可以表征mRNA的运动轨迹，但无法有效确认mRNA是否与DNA模板链结合，发生转录过程；此外，荧光方法也无法直接测量得到活体细胞内部生命活动产物变化。
[0004]近年来，表面增强拉曼散射(SERS)技术在生物学检测中凸显出独特优势：将有表面增强效应的纳米颗粒导入细胞，可实现细胞内拉曼信号的无损测量和实时检测，同时，当目标检测物含量较少时，表面增强拉曼散射方法也可以获得很强的拉曼信号。国际上已开展大量生物拉曼相关的研究，通过配体修饰纳米颗粒的方法，一些工作已经可以定向观测活细胞内特定蛋白或细胞器的拉曼光谱变化，进而分析其性质的变化。但是，由于细胞内结构复杂，拉曼信号强度和峰位可能受到细胞内部环境影响，测量过程中表面增强拉曼散射信号很容易出现波动。现有表面增强拉曼散射测量方法均不能确定活细胞内拉曼信号的测量基准，这会显著影响拉曼信号的可重复性和准确性。此外，由于纳米颗粒进入细胞后自发性趋于聚集，表面增强拉曼散射方法同样存在非特异性检测信号。现有表面增强拉曼散射方法也仅被应用于特定蛋白或细胞器拉曼光谱检测，尚无法确认细胞内生命活动参与物质是否结合，无法实现对细胞内部特定生命活动的定位成像和表征。
[0005]综上所述，现有活体细胞内单分子检测方法尚不能实现对生命活动参与物质的定向成像及表征；表面增强拉曼光谱法在活体细胞单分子检测领域具有一定优势，但其表征信号稳定性较差，缺乏基准信息，测量中可能出现非特异性信号，且尚未被应用于活体细胞内部特定生命活动的定位成像和表征。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提出了检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法，利用该方法可以同时实现细胞生命活动定向成像、表征，有助于准确研究分析外界刺激对细胞生命活动的影响，具有检测准确性强、重复性好等优点，具有科学研究和临床应用价值。
[0007]本专利技术提出了一种检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法(1)提供第一类纳米颗粒、第二类纳米颗粒和第三类纳米颗粒；其中，所述第一类纳米颗粒是通过使用参与细胞生命活动的物质A修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒；所述第二类纳米颗粒是通过使用参与所述细胞生命活动的物质B修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒；所述第三类纳米颗粒是通过使用配体C和具有稳定表面增强拉曼信号的物质E修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒，所述配体C可与至少一种细胞器上的受体D结合；(2)将所述第一类纳米颗粒、第二类纳米颗粒和第三类纳米颗粒导入待测细胞，所述物质A和物质B参与生命活动，在生命活动过程中所述物质A和物质B结合，使得第一类纳米颗粒和第二类纳米颗粒组成二聚体；(3)采用拉曼光谱仪对所述待测细胞进行扫描，检测得到所述物质A和物质B拉曼特征峰同时存在的二聚体表面增强拉曼散射信号，确定所述生命活动在细胞中的发生位置，再以所述发生位置周围的所述物质E的拉曼光信号作为基准，确定所述二聚体表面增强拉曼光谱强度和峰位置，以确定所述待测细胞生命活动状态。
[0008]两个保持一定距离且具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒，即可以形成二聚体，二聚体增强拉曼光谱信号远强于单个纳米颗粒诱导产生的表面增强拉曼光谱信号。因此，在生命活动过程中，当且仅当物质A与物质B结合时，二者所修饰的纳米颗粒配对，形成二聚体，从而诱导产生物质A与物质B的二聚体的表面增强拉曼散射。由于未形成二聚体，未配对的第一类和第二类纳米颗粒仅会产生物质A或物质B单独的表面增强拉曼散射信号，且其信号强度会显著弱于二聚体信号。因此，通过对信号强度和特征峰的观测，即可确定是否存在二聚体表面增强拉曼散射信号，一旦出现物质A与物质B同时存在的二聚体表面增强拉曼散射信号，即可有效证明生命活动中物质A与物质B相结合，进而实现活体细胞内生命活动表征。由于二聚体表面增强拉曼散射强度与普通拉曼散射存在数量级上的差异，通过拉曼光谱扫描观测信号强度，可确认活体细胞内所述生命活动的发生场所，实现活体细胞生命活动定向成像，检测拉曼光谱的特征峰，还可确认所述生命活动产物。第三类纳米颗粒表面修饰配体及具有特定表面增强拉曼信号的物质，配体与细胞内的特定细胞器受体结合，具有特定表面增强拉曼信号的物质自身的拉曼信号可以成为细胞内部拉曼信号的检测基准，细胞内部环境的整体变化将不会干扰特定生命活动信号变化，进而保障细胞内拉曼信号可重复、高精度的检测。通过检测有基准条件下，确定细胞内部二聚体表面增强拉曼散射强度和峰位置，即可确定活体细胞生命活动状态。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法还可以具有下列附加技术特征：
[0010]根据本专利技术的实施例，所述物质A包括但不限于：单链脱氧核糖核酸、单链核糖核酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或蛋白质；所述物质B包括但不限于：受体、辅助因子、转录因子、聚合酶、单链脱氧核糖核酸、单链核糖核酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、氨基
酸、抗原、脂质和/或糖；所述配体C为一种配体或多种不同配体；所述纳米颗粒选自金纳米颗粒或银纳米颗粒。
[0011]根据本专利技术的实施例，在修饰所述物质A、物质B、配体C、物质E之前，在所述纳米颗粒的表面进行表面修饰，所述表面修饰方法包括：表面覆盖修饰、化学修饰、外膜修饰和/或物理修饰。
[0012]根据本专利技术的实施例，步骤(2)中，将所述纳米颗粒导入细胞的方式包括：细胞胞吞、吞噬、胞饮或受体介导的内吞。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测分析活体细胞生命活动状态的修饰二聚体表面增强拉曼的方法，其特征在于，包括：(1)提供第一类纳米颗粒、第二类纳米颗粒和第三类纳米颗粒；其中，所述第一类纳米颗粒是通过使用参与细胞生命活动的物质A修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒；所述第二类纳米颗粒是通过使用参与所述细胞生命活动的物质B修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒；所述第三类纳米颗粒是通过使用配体C和具有稳定表面增强拉曼信号的物质E修饰具有表面增强拉曼效应的纳米颗粒，所述配体C可与至少一种细胞器上的受体D结合；(2)将所述第一类纳米颗粒、第二类纳米颗粒和第三类纳米颗粒导入待测细胞，所述物质A和物质B参与生命活动，在生命活动过程中所述物质A和物质B结合，使得第一类纳米颗粒和第二类纳米颗粒组成二聚体；(3)采用拉曼光谱仪对所述待测细胞进行扫描，检测得到所述物质A和物质B拉曼特征峰同时存在的二聚体表面增强拉曼散射信号，确定所述生命活动在细胞中的发生位置，再以所述发生位置周围的所述物质E的拉曼光信号作为基准，确定所述二聚体表面增强拉曼光谱强度和峰位置，以确定所述待测细胞生命活动状态。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质A包括但不限于：单链脱氧核糖核酸、单链核糖核酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或蛋白质；所述物质B包括但不限于：受体、辅助因子、转录因子、聚合酶、单链脱氧核糖核酸、单链核糖核酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸、抗原、脂质和/或糖；所述纳米颗粒选自金纳米颗粒或银纳米颗粒；所述配体C为一种配体或多种不同配体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在修饰所述物质A、物质B、配体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兴，樊傲然，李玉璞，王海东，马维刚，常智杰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：