外周血单个核细胞的冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤：将外周血单个核细胞与预处理液混合，于‑10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。本发明专利技术通过二步法对PBMC进行处理，并在预处理液及冻存液中配合加入特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合对PBMC进行冻存保护，能够显著地提高长时间冻存后复苏PBMC细胞的数量、活性，并维持其功能，确保PBMC长期低温冻存的效率。

【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞的冻存方法
本专利技术涉及细胞冻存
，特别是涉及一种外周血单个核细胞的冻存方法。
技术介绍
外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞群体，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤细胞)和单核细胞等多种免疫细胞及造血干细胞。PBMC在人体中含量丰富，其在疾病诊断、药物分析、抗体研究、细胞治疗等前沿医学领域中发挥重要作用，具有广阔的医学应用前景。目前最热门的免疫治疗策略，其主要思路为：在年轻时保存自体健康的免疫细胞(即指PBMC)，中老年经过体外增殖处理后回输体内。这一技术能显著改善年龄导致的免疫力低下和亚健康，有利于提高中老年的寿命和亚健康人群的生活质量，但其重要的技术步骤之一，即为PBMC细胞的超低温长期储存和复苏。PBMC在医学研究和临床上应用广泛，故其冻存方式尤为重要。与其它细胞相比，PBMC细胞直径区间相对较小，总体上更为脆弱，冻存复苏的处理操作很容易破坏PBMC的形态和功能，复苏后可明显观察到细胞结团、裂解、数目减少，活性降低。目前细胞冻存采用-196℃液氮程控降温保存，理论上可使细胞保存23～25年，数量和活力达到90％。但PBMC的复苏数目和活率常常仅有50％～80％，时间仅有2～3年，甚至更低，严重影响了PBMC细胞的研究和应用。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种长时间冻存复苏后细胞得率活率较高的外周血单个核细胞的冻存方法。一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤：将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。在传统的细胞冻存方法中，往往都是将待冻存的细胞离心收集后直接与冻存液混合，然后进入程序性降温过程，以追求最大限度地保存细胞活力，提高冻存的质量。而本专利技术针对外周血单个核细胞的冻存采用的是不同的思路，主要为先通过预处理液对外周血单个核细胞进行预处理，预处理液中的海藻糖可与细胞膜中的脂质相互作用从而保护细胞膜的完整性，而抗坏血酸可恢复失活的维生素E，减少活性氧(ROS)诱导的DNA破坏，并减少脂质过氧化。如此，通过海藻糖和抗坏血酸协同配合诱导细胞提前建立抵抗超低温冻存产生的凋亡、坏死、裂解作用，使细胞以更佳的状态进入后续冻存流程。然后，再将经过预处理的外周血单个核细胞与冻存液混合，通过在冻存液中加入三种特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合即海藻糖、抗坏血酸和ROCK激酶抑制剂，可以稳定细胞膜，保护胞内蛋白不被降解，有效提高冻存复苏后PBMC的数量、活性和功能。最后，将PBMC进行程序性降温，并转入液氮中长期保存。在其中一个实施例中，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/L～150mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/L～0.375mmol/L。在其中一个实施例中，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/L～110mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L。在其中一个实施例中，所述冻存液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/L～150mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/L～0.375mmol/L，所述ROCK激酶抑制剂的浓度为5mmol/L～15mmol/L，所述血清的体积百分比为70％～90％，所述DMSO的体积百分比为8％～12％。在其中一个实施例中，所述冻存液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/L～110mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L，所述ROCK激酶抑制剂的浓度为9mmol/L～11mmol/L。在其中一个实施例中，所述外周血单个核细胞以白膜层细胞的形式与所述预处理液混合。在其中一个实施例中，所述白膜层细胞通过以下步骤得到：获取外周血并离心收集血细胞沉淀，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集白膜层细胞。在其中一个实施例中，所述接触的过程伴随外周血单个核细胞的离心分离。在其中一个实施例中，所述外周血单个核细胞与所述冻存液混合后，细胞密度为(0.5～2)×107个/mL。在其中一个实施例中，所述ROCK激酶抑制剂包括AR-12286、Y-27632和SNJ-1656中的一种或多种。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术一实施例的外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤S1～S2：S1、将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min。其预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸。S2、从预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存。其冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。在传统的细胞冻存方法中，往往都是将待冻存的细胞离心收集后直接与冻存液混合，然后进入程序性降温过程，以追求最大限度地保存细胞活力，提高冻存的质量。而本专利技术针对外周血单个核细胞的冻存采用的是不同的思路，主要为先通过预处理液对外周血单个核细胞进行预处理，预处理液中的海藻糖可与细胞膜中的脂质相互作用从而保护细胞膜的完整性，而抗坏血酸可恢复失活的维生素E，减少活性氧(ROS)诱导的DNA破坏，并减少脂质过氧化。如此，通过海藻糖和抗坏血酸协同配合诱导细胞提前建立抵抗超低温冻存产生的凋亡、坏死、裂解作用，使细胞以更佳的状态进入后续冻存流程。然后，再将经过预处理的外周血单个核细胞与冻存液混合，通过在冻存液中加入三种特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合即海藻糖、抗坏血酸和ROCK激酶抑制剂，可以稳定细胞膜，保护胞内蛋白不被降解，有效提高冻存复苏后PBMC的数量、活性和功能。最后，将PBMC进行程序性降温，并转入液氮中长期保存。综上所述，本专利技术通过二步法对PBMC进行处理，并在预处理液及冻存液中配合加入特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合对PBMC进行冻存保护，经实验证明，该方法能够显著地提高长时间冻存后复苏PBMC细胞的数量、活性，并维持其功能，确保PBMC长期低温冻存的效率，有效地解决了PBMC长期超低温冻存后复苏数目和活率显著下降的问题，有利于推进PBMC细胞医学研究和临床应用的发展。在一个具体示例中，预处理液中，海藻糖的浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血单个核细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；/n从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。/n

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；
从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。


2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/L～150mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/L～0.375mmol/L。


3.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/L～110mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L。


4.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/L～150mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/L～0.375mmol/L，所述ROCK激酶抑制剂的浓度为5mmol/L～15mmol/L，所述血清的体积百分比为70％～90％，所述DMSO的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴道贫，陶然，覃绍君，赖小华，
申请(专利权)人：广州准优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44