一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用，在本发明专利技术中，转染LncRNA

【技术实现步骤摘要】
一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用。

技术介绍

[0002]神经干细胞是一类具有强大自我更新能力且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜力的，并能提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞分布在中枢神经系统的很多部位，如嗅球、海马齿状回、纹状体、脑室带、室下带、中脑、脊髓等，其中侧脑室的室壁下层和海马齿状回的颗粒下层被认为是成体内的两个神经干细胞聚集区。神经干细胞具有强大的可塑性且在体外可持续扩增，为治疗众多不可治愈的神经系统疾病带来了希望，如缺血性脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默症等。
[0003]在一般情况下，神经干细胞处于静息状态，当受到一定损伤刺激之后，如：缺血，将启动分化过程以修复组织。在此过程中神经干细胞可以迁移并归巢到特定的损伤部位，并不断地调整自身行为。但是神经干细胞的增殖、分化受诸多因素影响，外源性移植的神经干细胞在脑内主要分化为胶质细胞，不能达到预期的修复效果。因此，如何调控神经干细胞在复杂的信号网络调控中实现有序的分化是目前神经干细胞领域的焦点问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用。
[0005]具体而言，本专利技术首先提供了一种用于调控神经干细胞分化的LncRNA
‑
OX1，其核苷酸序列为：
[0006]5'
‑
attgcagccgatcagcagaaaactggagtctggcgatccgacaagagtcttggggatgtagcatacgtggtccggggcagctattccagtgagcgcgaacaacaccctcatgcgaaagtcttttcgcaatagggcctagacgtctggttcaggtatcgacctggagttcatttctaggggctactctagaaggatcaccgaggcctatggtcagctccagcgaacaaagcaaaggcttaacgtatttc
‑
3'。
[0007]本专利技术的目的在于提供一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法。通过对LncRNA
‑
OX1的调控，建立调控神经干细胞分化和抑制分化的方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于该方法为：将LncRNA
‑
OX1转染神经干细胞，以促进神经干细胞的分化；通过沉默载体siRNA，使LncRNA
‑
OX1的表达显著下调，以抑制神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化。
[0008]进一步地，本专利技术还提供了一种促进神经干细胞的分化的方法，包括如下步骤：
[0009]1)构建含有所述LncRNA
‑
OX1的重组表达质粒，
[0010]2)将步骤1)中的重组表达质粒转染神经干细胞。
[0011]优选地，步骤1)中包括扩增LncRNA
‑
OX1的步骤和将LncRNA
‑
OX1与载体LV18(CMV/Puro)连接构建重组表达质粒的步骤。
[0012]进一步优选地，步骤1)中用于扩增LncRNA
‑
OX1的上下游引物含有含有SpeI和NotI酶切位点，其序列如下：
[0013]LncRNA
‑
OX1
‑
F'：5'
‑
tctACTAGTattgcagccgatca
‑
3'；
[0014]LncRNA
‑
OX1
‑
R'：5'
‑
aatGCGGCCGCGaaatacgttaagc
‑
3'。
[0015]进一步优选地，步骤1)中扩增LncRNA
‑
OX1的PCR反应体系为总体积25μL，包括：DNA模板2μL，上下游引物各2μL，10
×
PCR Buffer 5μL，Taq DNA聚合酶2μL，dNTPs 2μL，ddH2O 12μL。
[0016]进一步优选地，步骤1)中扩增LncRNA
‑
OX1的PCR反应程序为95℃预变性5min；然后94℃变性60s；53℃退火40s；72℃延伸60s。共40个循环。PCR反应完成后，利用琼脂糖电泳并切胶回收目的基因片段。
[0017]进一步优选地，步骤1)中还包括采用SpeI和NotI对LncRNA
‑
OX1片段和载体LV18(CMV/Puro)进行酶切，37℃酶切2小时。
[0018]进一步优选地，步骤1)中的50μL酶切体系包括：目的基因片段/载体LV18 5μL，10
×
工具酶缓冲液5μL，SpeI酶5μL，NotI酶5μL，ddH2O30μL。
[0019]进一步优选地，步骤1)中还包括采用T4 DNAligase连接酶切得到的目的基因片段和线性化的LV18载体，即可得到重组LncRNA
‑
OX1
‑
LV18载体。
[0020]进一步优选地，步骤1)中的连接反应为45℃温育2h，50μL连接体系包括：10
×
T4 DNA连接酶缓冲液5μL，线性化的LV18载体5μL，目的基因片段5μL，T4 DNAligase 5μL，ddH2O 30μL。
[0021]优选地，步骤2)是采用以阳离子脂质体转染试剂梭华(SofastTM)介导重组质粒DNA的转染。将重组LncRNA
‑
OX1
‑
LV18载体转染未分化rNSCs
‑
12神经干细胞，并连续培养。
[0022]进一步地，本专利技术还提供了一种抑制神经干细胞的分化的方法，包括如下步骤：
[0023]a)根据LncRNA
‑
OX1全长基因序列设计siRNA分子；
[0024]b)将步骤a)中的siRNA转染到神经干细胞。
[0025]优选地，步骤a)中的siRNA分子为siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4，其序列信息如下所示：SiRNA1：5'
‑
aatagctgccccg
‑
3'、SiRNA2：5'
‑
ttgttcgcgctca
‑
3'、SiRNA3：5'
‑
ctaggccctattg
‑
3'、SiRNA4：5'
‑
gagctgaccatag
‑
3'。
[0026]进一步优选地，步骤b)是采用RNAiMAXReagent试剂将siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4转染到神经干细胞中。
[0027]进一步优选地，所述s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于调控神经干细胞分化的LncRNA
‑
OX1，其特征在于，所述LncRNA
‑
OX1的核苷酸序列为：5'
‑
attgcagccgatcagcagaaaactggagtctggcgatccgacaagagtcttggggatgtagc atacgtggtccggggcagctattccagtgagcgcgaacaacaccctcatgcgaaagtcttttcgc aatagggcctagacgtctggttcaggtatcgacctggagttcatttctaggggctactctagaag gatcaccgaggcctatggtcagctccagcgaacaaagcaaaggcttaacgtatttc
‑
3'。2.一种神经干细胞分化和/或抑制分化的调控方法，其特征在于，通过对权利要求1中所述LncRNA
‑
OX1的调控，建立调控神经干细胞分化和抑制分化的方法，将LncRNA
‑
OX1转染神经干细胞，以促进神经干细胞的分化；通过沉默载体siRNA，使LncRNA
‑
OX1的表达显著下调，以抑制神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化。3.一种抑制神经干细胞的分化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)根据权利要求1所述的LncRNA
‑
OX1全长基因序列设计siRNA分子；b)将步骤a)中的siRNA转染到神经干细胞。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a)中的siRNA分子为siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴道贫，赖小华，谢秀风，韦德生，
申请(专利权)人：广州准优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：