一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用制造技术

一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用，所属生物技术领域，培养基成分包括基础培养基、增殖培养基添加剂、一级分化培养添加剂和二级分化培养添加剂；增殖培养基添加剂包括非必需氨基酸、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C葡萄糖苷、维生素E、黄体酮、叶酸、丙谷二肽和雷帕霉素；一级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白包合物；二级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白微囊。本发明专利技术的培养基在培养前期采用添加生长因子和丙谷二肽配合雷帕霉素促进神经干细胞增殖，中期采用胎牛血清白蛋白包合物释放神经元分化促进剂，后期采用胎牛血清白蛋白微囊进一步释放神经胶质细胞分化促进剂，能够实现安全良好的增殖和分化效果。殖和分化效果。

【技术实现步骤摘要】
一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用。

技术介绍

[0002]神经干细胞是具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。神经干细胞主要包括神经管上皮细胞、放射状胶质神经元和神经母细胞。其中，神经管上皮细胞的分裂能力最强，存在于胚胎时期，分化能够产生放射状胶质神经元和神经母细胞；放射状胶质神经元能够分化产生新的放射状胶质神经元、神经元前体细胞或胶质细胞；神经母细胞是成年人体中主要存在的神经干细胞，分化能够产生神经前体细胞、神经元和各类神经胶质细胞。神经干细胞对神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的治疗作用，因此，体外培养扩增和分化神经干细胞具有很大的医疗价值。另外，神经干细胞作为生物医学工程以及体外模型研究中的种子细胞，也需要进行体外增殖或分化培养，以供研究。
[0003]目前，培养扩增和分化神经干细胞的数量不高，制备效率低，从神经组织中进行原代分离，会受到组织来源的限制，例如神经管上皮细胞分化是需要获得多个胚胎，用胰蛋白酶消化传代神经干细胞的常规方法培养神经干细胞，采用Neurobasal培养基配合明胶预处理过的培养瓶进行贴壁培养，扩增和分化数量较少，进行多次培养扩增才能获得一定量神经干细胞；而由其它种类成体干细胞分化而来的神经前体细胞，由于成体干细胞本身分化能力有限，难以完全再生功能性神经干细胞，在功能上又存在限制性。因此，增殖和分化神经干细胞的质量和数量是本领域需要解决的问题，因为干细胞的来源途径就是几种，难以再扩展，因此目前提高增殖和分化主要是从方法和培养基方面进行改进。
[0004]培养基是作用于神经干细胞的培养过程中所需要的特殊培养环境，以达到神经干细胞的贴壁或增殖效果。目前，干细胞培养分为有饲养层培养和无饲养层培养两大类，培养体系不同，所用到的培养基自然也会有所差别。通常情况下，促进扩增的培养基需要抑制分化，防止分化后不适合长期扩增培养；另外，培养基中牛血清的添加量影响着分化方向，促进神经干细胞向神经胶质细胞分化需要高浓度牛血清，而神经干细胞向神经元分化则需要采用低浓度牛血清，由于培养基环境条件互相制约，因此，几乎没有能够同时达到良好增殖和分化效果的培养基。

技术实现思路

[0005]针对现有神经干细胞体外培养难以同时达到良好的增殖和分化效果的问题，本专利技术提供一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用，培养前期采用添加生长因子和丙谷二肽配合雷帕霉素促进神经干细胞增殖，中期采用胎牛血清白蛋白包合物释放神经元分化促进剂，后期采用胎牛血清白蛋白微囊进一步释放神经胶质细胞分化促进剂，完成良好的增殖和分化效果。其具体技术方案如下：
[0006]一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，培养基成分包括增殖培养基、一级分化培养添加剂和二级分化培养添加剂，增殖培养基包括基础培养基和增殖培养基添加剂；增殖培养基添加剂包括非必需氨基酸、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C葡萄糖苷、维生素E、黄体酮、叶酸、丙谷二肽和雷帕霉素；一级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白包合物；二级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白微囊。
[0007]上述技术方案中，基础培养基为RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基或α
‑
MEM培养基。
[0008]上述技术方案中，培养基成分包括基础培养基12～15g、非必需氨基酸8～10μg、谷氨酰胺200～250mg、表皮生长因子10～20μg、碱性成纤维细胞生长因子5～10μg、维生素C葡萄糖苷20～30mg、维生素E10～20μg、黄体酮3～5μg、叶酸4～6μg、丙谷二肽3～5μg、雷帕霉素30000～35000IU、胎牛血清白蛋白包合物80～150mg、胎牛血清白蛋白微囊1～3g、去离子水1L。
[0009]上述技术方案中，胎牛血清白蛋白包合物的制备方法为，将饱和量β
‑
环糊精加入蒸馏水，在40～50℃条件下制成饱和溶液，降温至25℃以下，过滤得到饱和滤液；然后将胎牛血清白蛋白冻干粉和Psora
‑
4的混合物加入到饱和滤液中，混合均匀，冰水浴冷却1～1.2h，过滤得到滤饼，即胎牛血清白蛋白包合物。
[0010]上述技术方案中，胎牛血清白蛋白冻干粉和Psora
‑
4的混合质量比为，胎牛血清白蛋白冻干粉:Psora
‑
4＝2:(1～1.5)。
[0011]上述技术方案中，胎牛血清白蛋白微囊的制备方法为，向胎牛血清白蛋白冻干粉、多聚
‑
L
‑
赖氨酸和梓醇的混合物中加入相对于混合物1～1.2质量倍量明胶水溶液和阿拉伯胶水溶液至润湿，微球混合研磨，得到研磨润湿物，然后再加入相对于研磨润湿物3～5质量倍量的明胶水溶液和阿拉伯胶水溶液，混匀，去除沉淀物，然后静置成囊，加入1～2体积倍量的去离子水稀释，转至冰水浴搅拌，静置待微囊沉降完全，除去上清液，得到胎牛血清白蛋白微囊。
[0012]上述技术方案中，胎牛血清白蛋白冻干粉、多聚
‑
L
‑
赖氨酸和梓醇的混合质量比为，胎牛血清白蛋白冻干粉:多聚
‑
L
‑
赖氨酸:梓醇＝5:(1～2):(1～2)。
[0013]上述技术方案中，明胶水溶液和阿拉伯胶水溶液的添加配比为，明胶水溶液:阿拉伯胶水溶液＝2:1，明胶水溶液质量浓度为5％，阿拉伯胶水溶液质量浓度为10％。
[0014]上述技术方案中，微球混合研磨为加入直径为0.5～1mm的半导体级石英球研磨混合2～5min。
[0015]上述技术方案中，胎牛血清白蛋白冻干粉采用γ射线照射3～10min。
[0016]上述技术方案中，非必须氨基酸为精氨酸:丝氨酸:脯氨酸＝(1～2):(1～2):(1～2)。
[0017]上述技术方案中，培养基应用于神经干细胞的增殖和分化。
[0018]本专利技术的一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基及其应用，与现有技术相比，有益效果为：
[0019]一、本专利技术培养基在培养前期采用添加生长因子和丙谷二肽配合雷帕霉素促进神经干细胞增殖，增殖效果明显，在增殖后的条件下进行分化，同时提高增殖和分化量。
[0020]二、本专利技术培养基在中期采用胎牛血清白蛋白包合物释放神经元分化促进剂，其
中，低浓度的胎牛血清白蛋白和Psora
‑
4能够促进神经元分化；此外，本专利技术培养基采用β
‑
环糊精和胎牛血清白蛋白包合，在加入培养基后，Psora
‑
4能够先进行分散，促进细胞先向神经元分化；胎牛血清白蛋白和β
‑
环糊精结合，使胎牛血清白蛋白释放时间长，能够保证持续的促进神经元分化。
[0021]三、本专利技术培养基在后期采用胎牛血清白蛋白微囊进一步释放神经胶质细胞分化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，其特征在于，培养基成分包括增殖培养基、一级分化培养添加剂和二级分化培养添加剂，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖培养基添加剂；所述增殖培养基添加剂包括非必需氨基酸、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C葡萄糖苷、维生素E、黄体酮、叶酸、丙谷二肽和雷帕霉素；所述一级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白包合物；所述二级分化培养添加剂为胎牛血清白蛋白微囊。2.根据权利要求1所述的一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，其特征在于，所述基础培养基为RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基或α
‑
MEM培养基。3.根据权利要求1或2所述的一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，其特征在于，所述培养基成分包括基础培养基12～15g、非必需氨基酸8～10μg、谷氨酰胺200～250mg、表皮生长因子10～20μg、碱性成纤维细胞生长因子5～10μg、维生素C葡萄糖苷20～30mg、维生素E10～20μg、黄体酮3～5μg、叶酸4～6μg、丙谷二肽3～5μg、雷帕霉素30000～35000IU、胎牛血清白蛋白包合物80～150mg、胎牛血清白蛋白微囊1～3g、去离子水1L。4.根据权利要求3所述的一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，其特征在于，所述胎牛血清白蛋白包合物的制备方法为，将饱和量β
‑
环糊精加入蒸馏水，在40～50℃条件下制成饱和溶液，降温至25℃以下，过滤得到饱和滤液；然后将胎牛血清白蛋白冻干粉和Psora
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4的混合物加入到饱和滤液中，混合均匀，冰水浴冷却1～1.2h，过滤得到滤饼，即胎牛血清白蛋白包合物。5.根据权利要求4所述的一种促进神经干细胞增殖和分化的培养基，其特征在于，所述胎牛血清白蛋白冻干粉和Psora
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴道贫，邹洁宜，练劲，韦德生，
申请(专利权)人：广州准优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：