一种司美格鲁肽的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种司美格鲁肽的纯化方法，其包括如下步骤：1)获得固相合成方法制备得到的裂解树脂以及脱除保护基的司美格鲁粗肽，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解司美格鲁肽粗肽；2)取司美格鲁肽粗肽溶液用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液备用；3)第一步纯化以反相填料为固定相，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱；4)第二步纯化以反相填料为固定相，稀醋酸溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱；5)将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得司美格鲁肽。本发明专利技术方法以含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解粗肽，溶解后的粗肽溶液pH更稳定不易析出，即避免了色谱柱和设备堵塞，又提高了分离效果。

【技术实现步骤摘要】
一种司美格鲁肽的纯化方法
本专利技术涉及一种多肽药物的纯化
，特别涉及司美格鲁肽的分离纯化方法，属于药物化学领域。
技术介绍
中文名：司美格鲁肽英文名：SemaglutideCAS号:910463-68-2分子式:C187H291N45O59分子量:4113.64其结构如下:司美格鲁肽是由诺和诺德公司研制开发的新一代长效GLP-1类似物,用于治疗II型糖尿病，司美格鲁肽除降底血糖之外还有减肥和保护心血管的功效，是目前GLP-1药物中降糖及减肥效果最好的一个药。FDA在2017年批准注射剂型上市，2019年9月20号批准口服剂型上市。司美格鲁肽为GLP-1类似物,与人GLP-1有94％同源性。司美格鲁肽的长效机制是基于对结构的修饰，司美格鲁肽在第8位修改为α-氨基异丁酸,用来增加稳定作用，避免被DPP-4酶降解。此外，通过结构修饰，把肽链第26位的赖氨酸位置连接上18碳脂肪二酸侧链，相比C16的利拉鲁肽，增长的碳链对白蛋白的亲和力增强5～6倍，与白蛋白结合，增大了本品的分子量，避免快速被肾脏清除并防止代谢性降解,延长体内半衰期。并把34位的赖氨酸替换成精氨酸，以确保26位C18侧链的稳定性。因此，本品半衰期长达1周,司美格鲁肽为GLP-1受体激动剂，结合且激活GLP-1受体，通过介导GLP-1受体，以葡萄糖依赖的方式，刺激胰岛素分泌，并降低胰高血糖素分泌。此外，血糖降低也与餐后初始阶段延迟胃排空有关。目前出现了较多关于多肽纯化的公开技术，如CN201711474148公开了一种纯化司美格鲁肽的方法、CN201811482820公开了一种司美格鲁肽纯化专用填料及其纯化方法、CN201911201916公开了一种司美格鲁肽的分离纯化方法、CN201810663478公开了一种纯化司美格鲁肽的方法。现有纯化方法存在粗肽样品溶解方法不稳定、对特定杂质去除不明显，纯化收率过低等问题。
技术实现思路
本专利技术针对司美格鲁肽的理化特征，提供了一种操作性强、工艺简单而稳定、收率高的司美格鲁肽纯化工艺。为实现上述目的本专利技术采取以下技术方案：一种司美格鲁肽的纯化方法，其包括如下步骤：1)获得固相合成方法裂解树脂以及脱除保护基的司美格鲁粗肽，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解司美格鲁肽粗肽；2)取司美格鲁肽粗肽溶液用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液备用；3)第一步纯化以反相填料为固定相，用含有机溶剂的缓冲盐溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于95％，单杂小于0.8％的组分浓缩；4)第二步纯化以反相填料为固定相，稀醋酸溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分；5)将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得司美格鲁肽。放进冻干盘，进行冷冻干燥，冷冻干燥解吸附温度为35摄氏度，真空压力为0.1pa。在本专利技术的实施例中，在步骤1)中所述的溶解样品所用的有机溶剂为极性有机试剂，优选为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种，更优选乙腈。在本专利技术的实施例中，在步骤3)中所述的溶解样品所用的有机溶剂为极性有机试剂，优选为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种，更优选乙腈。在本专利技术的实施例中，有机溶剂的体积百分比为10％-30％，优选15-25％；且步骤1)和步骤3)中有机溶剂体积百分比相差不高于10％。在本专利技术的实施例中，在步骤1)和步骤3)中所述的磷酸盐缓冲溶液包括磷酸三乙胺、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾的缓冲盐体系，其中优选磷酸三乙胺，磷酸三乙胺体积百分比为0.05％-0.8％，步骤1)优选0.2％，步骤2)优选0.2％。在本专利技术的实施例中，在步骤1)和步骤3)中所述的磷酸盐缓冲溶液pH为6.5-9，优选pH7-8。优选以三乙胺调节pH值。在本专利技术的实施例中，在步骤3)所述的反相填料包括四烷基硅烷键合硅胶填料、八烷基硅烷键合硅胶填料，其粒径在5-100微米之间；优选八烷基硅烷键合硅胶填料，10μm。在本专利技术的实施例中，步骤4)中所述的反相填料为十八烷基硅烷键合硅胶填料，其粒径在5-100μm之间，优选粒径10μm。在本专利技术的实施例中，在步骤4)中所述的稀醋酸浓度为0.01％-1.0％(体积比)，优选0.2％(体积比)。在本专利技术的实施例中，步骤3)中梯度洗脱的方法为A％：80％-60％，B％：20％-40％，线性梯度洗脱60min。在本专利技术的实施例中，步骤4)中梯度洗脱的方法为A％：70％-50％，B％：30％-50％，线性梯度洗脱60min。在本专利技术的实施例中，所述的纯化方法为去除司美格鲁肽消旋杂质的方法，优选地，所述的司美格鲁肽消旋杂质为H-D-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OCDA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH【His1消旋】以及H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-D-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OCDA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH【Ala18消旋】。在本专利技术的实施例中，H-D-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OCDA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH【His1消旋】指司美格鲁肽中第1位的His发生消旋。在本专利技术的实施例中，H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-D-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OCDA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH【Ala18消旋】指司美格鲁肽中第18位的Ala发生消旋。和现有技术比较，本专利技术具有以下优点：1、司美格鲁粗肽含有大量三氟乙酸，以往专利技术用稀氨水或者乙腈溶解，很难控制粗肽溶液的pH值，本专利技术用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解粗肽，溶解后的粗肽溶液pH更稳定不易析出，即避免了色谱柱和设备堵塞，又提高了分离效果。同时增加了对粗肽的溶解能力，粗肽浓度达到50g/L。2、司美格鲁肽及其杂质溶解性特别差，在本专利技术中步骤3)中A流动相和粗肽溶解液基本相同，这样避免样品在进入色谱柱时由于流动相体系差异过大而造成样品析出和减少样品在柱头扩散效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种司美格鲁肽的纯化方法，其包括如下步骤：/n1)获得固相合成方法制备得到的裂解树脂以及脱除保护基的司美格鲁粗肽，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解司美格鲁肽粗肽；/n2)取司美格鲁肽粗肽溶液用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液备用；/n3)第一步纯化以反相填料为固定相，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于95％，单杂小于0.8％的组分浓缩；/n4)第二步纯化以反相填料为固定相，稀醋酸溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分；/n5)将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得司美格鲁肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种司美格鲁肽的纯化方法，其包括如下步骤：
1)获得固相合成方法制备得到的裂解树脂以及脱除保护基的司美格鲁粗肽，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液溶解司美格鲁肽粗肽；
2)取司美格鲁肽粗肽溶液用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液备用；
3)第一步纯化以反相填料为固定相，用含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于95％，单杂小于0.8％的组分浓缩；
4)第二步纯化以反相填料为固定相，稀醋酸溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分；
5)将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得司美格鲁肽。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，在步骤1)中有机溶剂为极性有机试剂，优选为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种，更优选乙腈。


3.根据权利要求1所述的纯化方法，在步骤3)中有机溶剂为极性有机试剂，优选为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种，更优选乙腈。


4.根据权利要求1所述的纯化方法，且步骤1)和步骤3)中有机溶剂的体积百分比为10％-30％，优选15-25％；且步骤1)和步骤3)中有机溶剂体积百分比相差不高于10％。


5.根据权利要求1所述的纯化方法，在步骤1)和步骤3)中，每1L含有机溶剂的磷酸盐缓冲溶液通过以下方法制备，量取2mL磷酸倒入700-750mL水，用三乙胺调pH到6.5-9，加入150-250mL乙腈，用水定容到1L。


6.根据权利要求1所述的纯化方法，步骤3)中梯度洗脱的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：马亚平，付信，张凌云，戴政清，王宇恩，周迎春，王庆磊，
申请(专利权)人：深圳深创生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44