一种司美格鲁肽制备方法技术

本发明专利技术涉及一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。本发明专利技术的方法采用了特殊的试剂组合进行结晶，晶体颗粒均匀，夹杂杂质少，能够通过过滤的方式进行分离。

【技术实现步骤摘要】
一种司美格鲁肽制备方法
本专利技术涉及多肽合成领域，具体涉及一种司美格鲁肽制备方法，尤其涉及结晶方法。
技术介绍
司美格鲁肽(Semaglutide)，商品名Ozempic，由丹麦诺和诺德公司研发，Ozempic被指定为饮食和运动的辅助手段，以改善2型糖尿病患者的血糖控制，注射剂于2017年12月05日在美国上市，2019年，FDA又批准口服司美格鲁肽上市，作为首款口服的GLP-1类似物糖尿病药物，该药的市场前景被广泛看好。司美格鲁肽也是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有94％的序列同源性，是诺和诺德开发的第二代脂肪链修饰GLP-1类似物，与第一代脂肪链修饰GLP-1类似物利拉鲁肽相比，其半衰期更长，剂量更低。司美格鲁肽保持了利拉鲁肽良好的安全性和降糖有效性，且减轻体重效果优于前两者。司美格鲁肽化学表述为Aib8,Arg34Lys26-[N-ε-ODA-ODA-(γ-Glu(N-α-18-十八烷酸-1-酰基))]-GLP-1(7-37)分子式为C187H291N45O59，相对分子质量为4113.58，CAS号为910463-68-2，序列信息如下：H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH目前，诺和诺德公司主要通过基因重组技术，利用酵母生产司美格鲁肽主链Arg34-GLP-19-37，然后连接上His-Aib；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-19-37，还需要利用化学手段和His-Aib反应，生成司美格鲁肽主链Aib8,Arg34-GLP-17-37；然后在Lys26的侧链氨基上接上长效修饰基团。由于Aib8,Arg34-GLP-17-37的侧链及N端氨基均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。现有技术中，提供了合成司美格鲁肽(Semaglutide)的Fmoc化学固相合成方法。US8129343和US8536122中采用Mmt、Mtt、ivDde和Dde保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再脱掉侧链保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；CN106928344采用Alloc保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再利用Pd(PPh3)4脱掉保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；而CN106478806则采用Dde-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，先顺序偶联完成Lys26的侧链长效修饰基团，然后再脱掉Lys26的α氨基保护基Dde，完成主链的偶联；在上述合成方法中均存在侧链修饰步骤繁多，工艺复杂，粗品的纯化难度较大等困难。专利CN108059666则采用Alloc-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，以CTC树脂为固相载体，用固相法合成得到单体Alloc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH,然后再作为单体固相合成得到司美格鲁肽。在树脂切割，粗品结晶工艺方基本都是采用裂解试剂对树脂进行切割、乙醚沉淀得到粗肽；RP-HPLC制备得到粗肽。目前没有发现司美格鲁肽的结晶沉淀专利，本专利技术人研究了司美格鲁肽制备过程中的沉淀方法，发现用乙醚作为溶剂存在一些问题，乙醚沉淀的晶型不好，只能通过离心得到粗品，离心过程会包裹杂质到粗品中，影响后一阶段的纯化以及产品质量，根据本领域常规采用方法都是采用乙醚作为溶剂当选用乙醚等醚类溶剂时，结晶基本比较粘稠，晶型不均一，过滤比较慢，所以一般只能采用离心方法得到产品，由于晶型不均一、离心不易过滤掉杂质，两者都会产生杂质包裹等因素，实例显示经过一次纯化后，其中一个主要杂质会明显偏大，需要更多次纯化才能得到更纯的成品，影响生产效率，也影响产品质量。同时乙醚属于易燃易爆危险化学品，生产操作过程中存在一定风险，如果采用更环保的乙酸乙酯等有机溶剂进行沉淀结晶，通过过滤方式，会更好的控制粗品中的杂质，同时该方式具有可控性强、重现性好、能量消耗低、绿色环保等特点，较传统工艺具有明显的优势。
技术实现思路
针对现有司美格鲁肽合成技术的需求，提供一种司美格鲁肽的结晶制备方法。有鉴于上述司美格鲁肽合成过程中结晶沉淀的一些缺点，本专利技术旨在提供一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。在本专利技术的实施方案中，步骤3)中结晶时裂解液，乙酸乙酯和环己的混合溶液的温度为2-25℃，优选为10-15℃。在本专利技术的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂解液体积的8-12倍，优选为10倍。在本专利技术的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解液过程中搅拌速度为100rmp，结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp-130rmp。在本专利技术的实施方案中，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中的乙酸乙酯和环己烷比例为1:2-2:1，优选为1:1。在本专利技术的实施方案中，步骤3)中结晶的时间为15-60分钟，优选为25-35分钟。在本专利技术的实施方案中，步骤4)中过滤的方法为减压过滤，优选采用减压漏斗进行过滤。在本专利技术的实施方案中，步骤4)中过滤时采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液洗涤滤饼2-5次。在本专利技术的实施方案中，步骤2)所述的裂解剂为TFA、TIS、EDT、PhOH和H2O的混合物，优选地TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5(体积比)；TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5(体积比)；裂解时间为1.5-3.5小时。在本专利技术的实施方案中，步骤1)中可以采用任意的方法制备全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物，例如，在固相合成树脂上从C端向N端依次合成主链，然后脱除Lys的侧链保护基，并偶联侧链。合成主链和侧链的方法可以为依次偶联氨基酸或多个氨基酸形成的多肽片段。也可以采用先合成主链的一部分，然后延伸生成主链，然后再完成主链的方法。采用已知的任意方法制成的全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物均可。在本专利技术的一个而具体实施方案中，步骤1)包括以下步骤：1-1)中Wang树脂上偶联Fmoc-Gly-OH，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；1-2)依照司美格鲁肽的肽序，采用合适的偶联体系，在Fmoc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：/n1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；/n2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；/n3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；/n4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种司美格鲁肽的制备方法，其包括如下步骤：
1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物；
2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团，获得裂解液；
3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行结晶；
4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。


2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中结晶时裂解液，乙酸乙酯和环己的混合溶液的温度为2-25℃，优选为10-15℃。


3.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂解液体积的8-12倍，优选为10倍。


4.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解液过程中搅拌速度为100rmp，结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp-130rmp。


5.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：马亚平，王宇恩，张凌云，戴政清，付信，周迎春，王庆磊，
申请(专利权)人：深圳深创生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44