一种利拉鲁肽固相合成方法技术

本发明专利技术公开了一种利拉鲁肽固相合成方法，属于多肽药物制备方法及纯化技术领域，该方法包括如下步骤：在活化剂系统的存在下，由王树脂为起始，通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽的顺序一一合成，共31个氨基酸组成，序列为：His‑Ala‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Arg‑Gly‑Arg‑Gly。其中Lys侧链修饰，依次偶联Fmoc‑Glu‑OtBu、棕榈酰氯、羧基活化。本发明专利技术具有杂质少、易纯化、产品收率高、降低工作量及生产成本的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种利拉鲁肽固相合成方法
本专利技术属于多肽药物制备方法及纯化
，具体是涉及一种利拉鲁肽固相合成方法。
技术介绍
利拉鲁肽，英文名为Liraglutide，其肽序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nε-(Nα-Palmitoyl)-Lγ-GLu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。利拉鲁肽是胰高血糖素样肽受体激动剂，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖的作用。但现有的利拉鲁肽主要是通过基因工程等生物学方法制备，生产成本高，技术难度大，研发周期长，不利于利拉鲁肽的工业化生产。而以往利拉鲁肽固相合成方法也存在步骤繁琐、废液多、成本高等缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种杂质少、易纯化、产品收率高、降低工作量及生产成本的利拉鲁肽固相合成方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种利拉鲁肽固相合成方法，包括以下步骤：步骤一，通过液相合成的方法制备赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步骤二，在活化剂环境的作用下，从王树脂为起始端，与Fmoc-Gly-OH偶联制备得到Fmoc-Gly-wang树脂；步骤三，通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步骤四，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽。在步骤一中，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成方法为：正十六烷酸、HOSu、DCC偶联得到Palmitoyl-OSu活化脂，然后和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu、DCC偶联得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，然后和Fmoc-Lys-OH反应得到赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。在步骤二中，树脂固体载体采用王树脂，所述活化剂系统选自DIC、HOBt和DMF，所述Fmoc-Gly-Wang树脂为0.2～0.4mmol/g取代度。在步骤三中，所述固相合成法包括以下步骤：1)在活化剂环境的作用下，从王树脂为起始端，与Fmoc-Gly-OH偶联制备得到Fmoc-Gly-wang树脂；2)采用由体积比为1：3的PIP和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；3)在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂；4)重复上述步骤，按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Boc)-OH。在步骤四中，裂解剂的筛选：在上述裂解剂中，最优的裂解剂为TFA：PhSMe：TES：EDT：H2O(90:1:2:2:5)即三氟乙酸：茴香硫醚：乙二硫醇：三乙基硅烷：水为90:1:2:2:5。纯化工艺：将从树脂裂解下来的利拉鲁肽粗品经过溶剂(优选乙醚：乙腈＝2:1)反复洗涤，在进入制备液相纯化之前进行初步纯化，将含量由63％提升至85％以上。可见，本专利技术在活化剂系统的存在下，由王树脂为起始；通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽的顺序一一合成，共31个氨基酸组成，序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Lys侧链修饰，依次偶联Fmoc-Glu-OtBu、棕榈酰氯、羧基活化。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：在纯化工艺中，使用乙醚/乙腈混合溶剂，对利拉鲁肽粗品进行打浆纯化的工艺，有效的将粗品纯度从63％提高至85％，这一步骤大大缩短了后面利拉鲁肽制备纯化的周期，同时也降低了生产成本。具体实施方式下面结合实施例进一步叙述本专利技术：实施例：本专利技术中涉及的试剂及原料如下：王树脂、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、三氟乙酸(TFA)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、苯甲硫醚、苯甲醚、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、哌啶(PIP)、苯酚及茚三酮、Fmoc-氨基酸(Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Lle-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、H-Glu-OtBu)。(1)棕榈酰基苯并三唑的合成(R5)：将10mmol苯并三唑(R3)溶于20℃的100ml甲基叔丁醚中，加入11mmol三乙胺，全溶后冰浴冷却，缓慢滴入11mmol棕榈酰氯(R4)，滴毕撤去冰浴，自然升到室温继续搅拌2h。过滤，滤液于60℃减压蒸干，剩余白色固体中加入50ml丙酮，60℃水浴溶解，置4℃冰箱中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利拉鲁肽固相合成方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一，通过液相合成的方法制备赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(N

【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽固相合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，通过液相合成的方法制备赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤二，在活化剂环境的作用下，从王树脂为起始端，与Fmoc-Gly-OH偶联制备得到Fmoc-Gly-wang树脂；
步骤三，通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤四，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽。


2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽固相合成方法，其特征在于：在步骤一中，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成方法为：正十六烷酸、HOSu、DCC偶联得到Palmitoyl-OSu活化脂，然后和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu和DCC偶联得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，然后和Fmoc-Lys-OH反应得到赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。


3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽固相合成方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丹，蒿海军，毕洪书，于航，
申请(专利权)人：辽宁药联制药有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21